蛋白含量测定及western步骤.doc

蛋白的提取和定量 组织用预冷1×BS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,，冰上孵育，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃ 蛋白质定量：BCA蛋白测定法 ①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 ②完全溶解蛋白标准品(BSA原浓度2mg/mL)mg/mL。 ③将标准品按0，， ul标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到 ul) 200 200 200 200 200 200 200 1mg/mLBSA 0 2 5 10 15 20 25 ddH2O 25 23 20 15 10 5 0 ④加2uL加到96孔板的样品孔中，加微升。⑤各孔加入200微升BCA工作液，37oC放置30分钟。注：也可以室温放置2小时，或60oC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。 ⑥测定A的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 ⑦计算调蛋白时所需BS和RSB的体积（调所有样品浓度至3ug/ul）： 总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul） RSB=1/5*总体积（ul） BS=总体积-RSB-蛋白体积（ul） 先加RSB（对蛋白保护作用），后加BS。最后放于-70℃保存。 Western Blot SDS 1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。 2. 表配制分离胶3. 灌胶：将配好的凝胶溶液沿玻璃板长面灌入，为方便可将玻璃板向后倾斜，灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到水与胶的界限。 4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。在此期间，打开水浴锅（100℃） 注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。 5．电泳前准备好：蛋白、Marker、1＊running buffer。蛋白在沸水中煮3－5min。6．拔梳子，立即用1＊running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。 7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。8．固定好后，加样。 跑道号码 加入物质及体积 1 3.5ul Marker (thermo #26616) 2-10 10ul Sample 9．玻璃电泳槽倒满1＊running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。 电极 黑对黑红对红，电压100V 电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。 Western-ECL 一、转膜 1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划，要切。注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。 2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。 3. 根据胶的长宽剪滤纸和膜（不能折，不能用手碰），膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大，膜可以大一点。将滤纸浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉） 转膜装置: ① 滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用 ② 三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致 ③ 滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER ④伏转印分钟 如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，BST洗一洗，晾干，保鲜膜包好后置四度保存。 再用之前，再用TRANS BUFFER洗一洗，BST洗一洗。即可封闭 二、杂交 1. 将*TBS稀释至1*（100ml→00ml），加入ml Tween 20（0.1％），即TBST。（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。） 2．配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。） 将膜用BST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记一定要在平的地方切）。 * 若此