培训课件--第九章 _细菌感染的分子生物学检验.ppt

二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容 （一）淋病奈瑟菌核酸的检测 1、PCR 是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。PCR引物选择的靶基因多采用： ①隐蔽质粒ccpB基因(ccpBHO1/3、1/2及ccpBN3/4); ② 16SrRNA基因(SL67/59、NGP1/2)； ③porA假基因； ④编码外膜蛋白基因（omp基因）； ⑤opa基因； ⑥胞嘧啶DNA甲基转移酶基因。 2、实时荧光定量PCR技术 目前临床检测NG的主要的分子生物学技术。 3、连接酶链反应 用于LCR方法检测的NG靶基因主要有opa基因和Pilin基因。对咽拭子标本具有很好的敏感性，但应注意避免污染导致的假阳性抑制物所致的假阴性。 4、链替代扩增技术 特异性扩增NG染色体PivNg基因，然后用荧光标记的探针检测其相对应的DNA靶序列。 （二）淋病奈瑟菌的耐药性检测 1、淋病奈瑟菌的主要耐药基因 ⑴gyrA和parC基因： DNA 旋转酶是氟喹诺酮类药物作用的靶位，由 gyrA 和parC 基因编码， gyrA基因突变可导致酶结构的改变，阻止氟喹诺酮类药物进入靶位，引起耐药。 gyrA基因突变与淋球菌低水平和中度水平氟喹诺酮类药物耐药有关，而对氟喹诺酮类药物高水平耐药是gyrA和parC共同参与基因突变的结果， gyrA和parC 是氟喹诺酮耐药决定区（QRDR）中的两个重要基因。 (2)penA、ponA基因： 青霉素结合蛋白(PBPS)为淋球菌重要的外膜蛋白。编码PBPS的基因主要有PenA、PonA基因，如果上述基因中发生突变，就会导致PBPS结构的改变，使PBPS与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产生耐药性。 (3)porB基因： 孔蛋白是镶嵌在淋球菌外膜的主要蛋白，与细菌的侵袭力有关，此外还具有物质运输功能。主要由porB基因编码，如果发生基因突变，导致孔蛋白120与121位氨基酸的改变，最终导致孔蛋白对亲水性抗生素渗透性下降，使药物在细胞内蓄积不足，从而产生耐药性。 (4)Mtr系统调控基因： MtrR调控基因的突变，导致它编码的MtrR阻遏蛋白减少或消失， Mtr操纵子的转录增强，使 MtrCDE 基因的表达增加，编码的泵蛋白外排活性增加，加大脂溶性抗生素的排出，使菌体内药物蓄积不足，从而导致耐药。 (5)erm基因： erm基因编码erm酶，如果发生突变， erm基因编码的酶可以使rRNA自动甲基化，从而使大环内酯类药物作用靶位—核糖体50S亚基蛋白改变，使药物与靶位亲和力下降引起耐药 2、淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术 （1）DNA测序： 目前应用该技术进行检测的淋病奈瑟菌耐药基因主要有gyrA基因、parC基因、erm基因等。 （2）PCR-SSCP （3）PCR-RFLP （4）基因芯片技术 三、分子生物学检验的临床意义 1、克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高了临床标本检测的阳性率和准确性。 2、通过分子生物学技术可以进行淋球菌感染的流行病调查。 3、可以准确、快速评价药物治疗的效果。 4、有利于淋病的鉴别诊断。 第四节 O157型大肠埃希菌的 分子生物学检验 感染性腹泻是世界范围内重要的公共卫生问题，其主要菌型是肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7，其产生强有力的细胞毒素—志贺菌样毒素Stx1和（或）Stx2。其主要作用部位是右半结肠，在盲肠、阑尾和升结肠引起黏膜的充血、水肿和细胞变性坏死，甚至血性腹泻，严重者可以导致死亡。 E.coli?O157:H7引起的出血性结肠炎是1982年在美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(CDC)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。 自82年发现至今，发生规模最大的一次爆发是97年5?月下旬，日本冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生6起集体食物中毒事件，人数多达1600人，导致3名儿童死亡，住院儿童达80人。同时日本仙台和鹿儿岛形成中毒人数过万人，死亡11人，波及44个都府县的爆发性食物中毒，引起全世界的关注。此外美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、苏格兰、威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。 我国自1986年徐州首次分离O157:H7以来，福建、甘肃、浙江、江苏和安徽等省市相继从人和动物中分离出O157:H7。1999年在江苏淮北部分地区及邻近的安徽部分地区发生的O157:H7感染暴发，患者超过2万人，死亡177人，流行长达7成个月，被认为是迄今为止世界范围内规模最大、死亡人数最多、时间最长、发病原因最复杂的一次。 一、O157型大肠埃希菌的基因组结构特征 大肠埃希菌的基因组由一个环状染色体和大质粒组