荧光定量PCR专题案例分析.ppt

植物荧光定量PCR技术 Real Time Quantitative PCR on Plants 主要内容 常规PCR技术简单回顾 实时荧光定量PCR技术的发展 实时荧光定量PCR技术的原理 实时荧光定量PCR技术常用方法 实时荧光定量PCR技术在植物上的应用 常规PCR技术简单回顾 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR（Polymerase Chain Reaction，PCR） 。 PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] 过去-----对基因进行定性 基因的差异表达最终决定着植物的形态建成------因此植物发育进程中或环境胁迫中基因的表达规律成为研究的热点。 现在---对基因进行定量 定性PCR---定量RT-PCR 对PCR扩增反应的终点产物可进行定量 和定性分析但无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（传统定量） 几种传统定量PCR 1 内参照法 2 竞争法 3 PCR－ELISA法 实时荧光定量PCR技术应运而生 在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用: 1.在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。 2. 此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。 Real-time instruments Applied Biosystems: Bio-Rad/MJ Research: Cepheid: Corbett Research: Eppendorf: Roche: LightCycler 1.5/480(罗氏) Stratagene: 实时荧光定量PCR的特点 特异性更强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 解决PCR污染问题 自动化程度高、操作简单 SYBR Green法 工作机理 实时荧光定量PCR模板定量策略2－－相对定量 标准曲线相对定量法 可在比较不同样品之间的RNA相对表达丰度时可采用 比较CT相对定量法（Comparative Delta-delta Ct ） 该方法与标准曲线相对定量法的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量。根据的是在PCR反应的指数期得到CT值来计算起始模板的量。 Mn-SOD and Cu-Zn/SOD play a key role in promoting embryogenic callus differentiation and early somatic embryo development in longan, but not Fe-SOD, and this result was first time to proposed that which kind of SOD s play an important role in plant embroys from mRNA level. ---------This will provide a theoretical basis for the regulation and control of longan early somatic embryogenesis. with the differentiation of embryogenic cultures, during the successive stages of longan somatic embryogenesis were detected with increased CAT expression level, the highest total CAT expression level was detected in cotyledonary embryo. ------which showed that CAT was closely related to the late stage development of longa