荧光染料选择和数据案例分析.ppt

荧光染料的选择及数据分析 张新梅 From BD Biosciences 荧光染料的选择 什么是流式细胞仪 在流动的状态中检测颗粒性物质各种物理及生物特征的一种仪器； 流式细胞仪原理 检测信号 散射光信号 前向散射光信号(FSC) 侧向散射光信号(SSC) 荧光信号 流式细胞仪原理 散射光信号 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。 流式细胞仪原理 前向角散射光信号（FSC） FSC反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强； FSC信号与细胞的折射率有关； 可用于表示细胞的凋亡； 区分死/活细胞时，可用于设门； 流式细胞仪原理 侧向角散射光信号（SSC） SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强； 流式细胞仪原理 FSC和SSC信号用于检测并显示细胞的物理学特征 流式细胞仪原理 荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。 流式细胞仪原理 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2) New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 荧光染料选择的必要性 多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的发现及抗体标记物的发展 但抗体组合选择非常复杂，如果随意选择荧光素搭配的抗体，不可能得到合适的结果。 在荧光染料的选择上多一点考虑，就可避免重复实验和错误的结果。 流式细胞仪原理 荧光信号 了解你的仪器 基本要求-了解你的仪器 试剂的选择从了解你的仪器的配置开始 激光（激发光源）：是否可以激发待选的荧光素 检测器：是否有足够的检测器来检测所要用的荧光抗体组合 光路设计：影响特别染料的检测效率 滤片：宽滤片提高检测能力，但也会检测到更多干扰光 荧光染料 488nm激光激发的染料 荧光染料 633nm激光激发的染料 荧光染料 UV激光激发的染料 荧光染料 常见荧光染料的发射波长 了解荧光素的性质 了解荧光素的相对荧光强度 荧光素/单抗结合物的亮度 每种荧光素的相对荧光强度不同 了解荧光素的相对荧光强度 各种荧光素在BD LSRII流式细胞仪上的染色指数 了解荧光素的相对荧光强度 每种荧光素的相对荧光强度不同 对一个既定的单抗来讲，因为结合的荧光素不同，阳性/阴性细胞的S/N比值可相差4-6倍 了解荧光素的相对荧光强度 每种荧光素的相对荧光强度不同 不同仪器的激光及滤片组合不同，荧光素的相对荧光强度也不同 了解荧光素的相对荧光强度 F/P比值 抗体上荧光素分子的多少（F/P）也会影响相对的荧光强度。 FITC和PerCP的结合物通常一个抗体分子上结合几个（2-9个，依抗体而定）荧光素分子。APC和PE与抗体结合一般是1：1。 复合染料PE-CY7和APC-CY7一般一个PE/APC分子结合多个CY7分子，一个PE/APC分子与抗体1：1结合 与之相反的是，复合染料PerCP-CY5.5，PerCP与CY5.5的比例是1：1 因为荧光素结合的化学因素的关系，IgM抗体一般与小分子的荧光素联结，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。 复合荧光染料-Tandem dye 复合荧光染料 被激发的Donor荧光素将能量转移给受者acceptor,需要满足条件: Donor的发射波长与acceptor的激发波长有重叠 Donor和Acceptor分子之间的距离不能太远(＜100A) 复合荧光染料 Fluorescence Resonance Energy Transfer 荧光染料 多色分析 荧光素的选择原则 选择荧光素需要考虑 抗原的密度 高表达的抗原可选择几乎所有的荧光素 低密度表达的抗原需要可提供较高S/N比值的荧光素如PE/APC 选择荧光素需要考虑 自发荧光 每种细胞群都有不同水平的自发荧光 所有的荧光通道均可观察到自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。 对自发荧光较强的细胞，选择发射波长长的荧光素（如APC）可得到较好的S/N比值。 对自发荧光比较弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善。可选用FITC。 选择荧光素需考虑 非特异结合 许多荧光抗体可产生低水平的非特异结合，使阴性细胞群的荧光超出自发荧光。 非特异结合由下列因素引起 单克隆抗体的同型抗体：一些IgG同型抗体可能与一些细胞上的Fc 受体结合 所用的荧光素 羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直标的抗体及一些复合染料标