荧光双染技术案例分析.ppt

基于蛋白蛋白、凋亡蛋白共定位的染色技术 杭州赫贝——专注医学实验外包服务 李海双重或多重免疫组织化学标记 概述 双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分（定性、定位、定量）分析不同抗原成分相互间功能的增消关系。 分类 免疫酶双重标记 免疫荧光双重标记 以酶催化不同底物呈现不同颜色 不同颜色的荧光色素配伍标记不同抗体，特异性结合相应抗原 免疫荧光双重标记染色 技术类型 直接法：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体。 间接法：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞。 前者特异、快速，后者敏感、多用 间接法免疫荧光双重标记染色 石蜡切片脱蜡复水 柠檬酸钠修复 封闭液封闭 混合一抗工作液，4℃过夜 混合二抗工作液，37℃1h DAPI染核 封片、不同激发波段观察 0.3M甘氨酸+1%BSA 405nm、488nm和585nm 附 图 总 结 要求 结构保存与抗原保护并重 抗体间无交叉反应、特异性高 操作要点 每次实验均需设置阳性对照、阴性对照和荧光标记物对照 一抗来源要求不同种属，二抗要求激发波段不同 双染前，要对每个抗体进行单标染色，确定合适染色条件 各步骤操作前，组织切片不易干掉 抗体孵育后，充分洗涤组织切片 组织背景较高的，宜进行组织封闭 TUNEL免疫组织化学双重标记染色 概述 同时检测同一组织切片上的细胞凋亡和相应抗原表达的双重染色技术 分类 酶法 荧光法 POD法+HRP法（DAB显色系统+AEC显色系统） 不同颜色的荧光色素标记核凋亡和抗体 前者适应性广，后者操作简单 TUNEL免疫组化荧光双重染色 冰冻切片室温平衡 0.5%Triton破膜 一抗工作液，4℃过夜 二抗工作液，37℃1h TdT酶工作液，37℃1h DAPI染核 封片、不同激发波段观察 免 疫 组 化 T U N E L 附 图