人血浆中非布司他的测定方法-LC-MS.docx

一种灵敏的方法定量测定人血浆中非布司他的浓度及其药动学应用摘要：一种改进的、简单的高度敏感的LC-MS/MS测定非布司他的方法已经建立，根据监管指南在100毫升人血浆中使用febuxostat-d7作为内标（IS）验证。用乙醚液液萃取从人的血浆中提取分析物和内标。色谱分离是在用混合乙腈和5Mm/L的甲酸铵(60:40, v/v)作为流动相，流速为0.5mL/min的C18烷硅胶柱上实现的。总流动时间为5.0分钟，非布司他和IS的洗脱分别发生在1.0和1.5分钟。线性响应函数的浓度范围在1-6000ng/mL(r0.99)。非布司他和内标的离子检测前体分别为m/z 317.1→261.1 和 324.2→262.1。日内和日间精密度(%RSD)分别在1.29–9.19%和2.85–7.69%范围内。上述方法已成功与用于人的药代动力学研究。关键词：非布司他；人血浆；LC-MS/MS检测方法；药代动力学前言非布司他（图一），化学名为2 -[ (3 - 氰 基- 4 - 异丁氧基) 苯基]- 4 - 甲基噻唑- 5 - 甲酸，是一种新型的选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，被用作高尿酸血症和痛风的治疗（恩斯特和福瑞威尔，2009）。根据血清和尿液中黄嘌呤氧化酶浓度的增加和尿酸水平的下降可证明其对黄嘌呤氧化酶有抑制作用，并且在嘌呤总量上缺乏显著性差异。，2008 年在欧盟获得批准上市，美国FDA 也于2009 年批准其上市。近日，有一个LC-MS和一些LC-MS/MS方法检测生物样品中非布司他的报道。最近Lukram et al（2012）用于非布司他人血浆样品检测的UPLC-MS/MS灵敏度不足以用于生物等效性的研究，因为这种方法的定量下线偏高(LLOQ; 75 ng/mL)血浆体积也偏大（500μL）。Ding et al（2012）报道了一种小鼠血浆的LC-MS检测方法，用咪达挫仑做内标定量下线可以达到10 ng/mL。Wang et al.（2013）描述了一种用LC-MS/MS检测人血浆样品中非布司他的方法，该方法的定量下线可达10 ng/mL，可以支持人体的药代动力学研究。作者在这种方法中用了febuxostat-d7作为内标。这两种方法(Ding et al., 2012; Wang et al., 2013)都需要用蛋白沉淀法对样品进行处理，这可能会导致离子抑制，因为这种方法不能有效地去除内源性物质如脂类、凝脂和脂肪酸(Nováková and Vlcková, 2009; Van Eeckhaut et al., 2009;Kole et al., 2011).。报道的定量下线LLOQ (10 ng/mL)在给药后的16小时不能定量检测到。任何药物的给药后定量，在末期增加时间点对于获得重要药动学参数至关重要。为了克服这些缺点，在目前的工作中，我们开发并验证了一个LC-MS/M S方法，在人血浆中(100 mL)非布司他的定量下线可以达到1 ng/mL。在样品准备的过程中，为了使分析过程中得到更干净的提取物，我们还使用了一个简单的液液萃取技术，同时使用febuxostat-d7作为内标来避免潜在的基质效应在分析物和内标的回收率所关联的问题和差异。通过建立灵敏度高于十倍的LC-MS/MS方法，我们可以在人类志愿者体内给药30小时后定量检测非布司他。经验证的方法成功的运用于南印度男性受试者口服80mg非布司他后定量测定非布的司他的浓度的临床药动学研究。图一。非布司他和非布司他-d7用到的缩写：LLE,液液萃取实验化学药品与试剂非布司他（纯度99.5%）由Apotex Pharmachem India Pvt. Ltd (Bangalore, India)提供。非布司他-d7(纯度99.2%, Fig. 1) 从Apotex Inc. (多伦多, 加拿大)获得。所用的高效液相色谱级乙腈由特里贝克(印度孟买)生产和高效液相色谱级的乙醚由RCl Labscan(海得拉巴,印度)生产。甲酸铵从默克有限公司采购 (印度孟买)。所有其他化学物质/试剂是研究级别的并且使用前未经纯化。LC-MS/MS分析所使用的水是用Millipore (印度班加罗尔)生产的Milli-Q水净化系统净化的水。用从Deccan’s Pathological Laboratory (Hyderabad, India)获得的K2EDTA作为抗凝剂控制人血浆并于-30℃储存。LC-MS/MS的设备与条件一套安捷伦HPLC1200串联系统（安捷伦科技，USA）包括研究用到的一个四元液相泵，一个自动进样器和一个在线脱气设备。分析物和内标是在SB-C18(74.6mm, 3.5 mm)色谱分离柱内分开，分析柱是由甲酸铵和乙腈(40:6 0,v / v)等度洗脱的流动相组成的5毫米