无菌检查法PPT概要.ppt

无菌检查法 一.微生物简单介绍 二.药典2015 三.无菌检测过程 1. 无菌的意义 1.1 当环境中的微生物进入了人体的内环境，并且进行了代谢等生命活动，会产生有对人体有害的物质。导致人生病，甚至死亡。 1.2 G- 细菌细胞壁结构中的脂多糖（内毒素），具有多种生物活性，对宿主有多种毒害作用，如发热、休克等 2.微生物的分类 原核：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体 真核：真菌（酵母菌、霉菌）、原生动物显微藻类 非细胞：病毒、亚病毒 3.细菌形态特征 无菌检测所用的菌种 - 细菌 G-：铜绿假单胞菌 G+：金黄色葡萄球菌 厌氧菌：生孢梭菌 杆菌：枯草芽孢杆菌 真菌 酵母菌：白色念珠菌 霉菌：黑曲霉 4.细菌的结构 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质 特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢 特殊结构 5.细菌细胞壁组成 革兰氏阳性菌 肽聚糖 磷壁酸 革兰氏阴性菌 脂多糖 磷脂 脂蛋白 肽聚糖 6.革兰氏---染色 1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用 来大致确定菌液滴的位置）。 2、 涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。 6.革兰氏---染色 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 （染色1min后用水洗） 第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 （染色1min后用水洗） 第三步：酒精脱色，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 第四步：番红复染3min，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌 染色结果 保持初染时深紫色的菌体，称为革兰氏染色阳性菌（G + 菌） 而能染红色的菌体称为革兰氏染色 阴性菌（G - 菌）。 2015 年 版 《 中国药典 》 无菌检查法的重大修订 1 、实验环境的重大修订 2、培养基体系的重大修订 3 、一、二、三部药典附录的整合修订。（...） 无菌检查法的重大修订 1.实验环境规定的修订 1.实验环境规定的修订 无菌检查法的重大修订 2.1培养基和培养温度的 修订 无菌检查法的重大修订 2.2培养基性能 修订 无菌检查法的重大修订 2.3培养基灵敏度检查 － ① 菌种加入培养基的修订 无菌检查法的重大修订 2.4灵敏度检查－ ②菌液制备用培养基的修订 无菌检查法的重大修订 3.方法验证（方法适用性试验）的修订 4.检查方法的修订 无菌检测过程 无菌检测过程 1.环境保证 2.培养基保证 3.方法的保证 4.结果的保证 无菌检测过程 1.环境保证 无菌检测过程 2.培养基保证 2.1无菌检测：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。 2.2灵敏度检查： 2.2.1菌液的制备 2.2.2菌液的接种 2.2.3结果判断 无菌检测过程 2.2灵敏度检查 2.2.1菌液的制备 无菌检测过程 2.2灵敏度检查 2.2.2菌液的接种 无菌检测过程 2.3灵敏度检查 2.2.3结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管 均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合 规定。 无菌检测过程 3.方法的验证 3.1菌液的制备 除大肠埃希菌（Escherichia?coli）〔CMCC（B）44?102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠?菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。