微生物学八章微生物与基因工程.ppt

第八章 微生物与基因工程第一节?微生物与基因工程的关系第二节 基因工程的基本过程 基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。 基因工程是一门崭新的生物技术。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并可设计和创建新的蛋白质和新的生物物种。 第一节?微生物与基因工程的关系 ?????????微生物与基因工程的关系密切，基因工程的产物和发展依赖于微生物学的理论和技术。微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。可以说一切基因工程操作都离不开微生物。 一、?? 微生物与克隆载体 克隆载体（cloning vector） ：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体将其运送到细胞中并进行复制和扩增。这种以扩增外源基因为目的的载体称为克隆载体。 作为克隆载体的条件是： ①载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个复制子； ②载体必须具有若干个限制酶的单一切割位点，便于外源基因的插入。并且这些酶切位点应位于载体复制的非必要去，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍能进行正常的复制。 ③载体必须具有可供选择的遗传标记。如抗生素的抗性基因等。 二、微生物与基因工程工具酶 基因工程所用的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化获得的。 同裂酶：有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。 同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别和切割序列各不相同，但却能产生相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。 2、DNA连接酶 DNA连接酶主要有两种： 一种是T4 DNA连接酶： T4DNA连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为6 800Da，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。 另一种是大肠杆菌DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为7 500Da，连接反应的能量来源是NAD+，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。 体外DNA连接方法目前常用的三种：（1）用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段；（2）用T4 DNA连接酶连接具有平末端DNA片段； （3）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。 三、?? 微生物作为克隆载体的宿主 为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，必须选择合适的克隆载体宿主。一个理想的克隆载体宿主。 第二节 基因工程的基本过程 基因工程操作主要步骤为：①分离或合成基因（切），②通过体外重组将基因插入载体（接），③将重组DNA导入细胞（转），④扩增克隆基因（增），⑤筛选重组体克隆（检），⑥对克隆的基因进行鉴定或测序，⑦控制外源基因的表达，⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物、工程菌（利用基因工程技术获得的具有新功能的微生物称为工程菌）。 一、目的基因的分离或合成 1，从基因文库中筛选 基因文库是指生物染色体基因组各DNA片断的克隆总体（即某一特定生物体全基因组的克隆集合）。人们可以根据目的基因的性质和序列从中筛选。 2，cDNA法 目的DNA可用反转录酶以mRNA为模板来合成。（以该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗脱下编码该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆。） cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。根据目的基因的特性可从中筛选。 3，化学合成法 如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。2kb的基因序列。 二、体外重组 目的基因用酶切下来，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子。 三、重组DNA导入细胞 DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合、受体细胞的电穿孔和显微注射等等。 1，外源DNA导入原核细胞 （1）转化或转染 如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌体质粒，则可通过转染方式进入细胞。 （2）λ噬菌体的体外包装和感染 如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入细胞。体外包装是将重组DNA分子