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第四节 微生物的诱变育种 和遗传工程 一、菌株的诱变和筛选 二、DNA重组技术的发展 三、基因工程 四、生物种系的遗传改良 一、菌株的诱变和筛选 物理致变剂 致变剂 e.g. X-rays, g-rays, UV 化学致变剂 e.g. base analogs, nitrous acid, alkylating, arylating agents UVL VL Photolyase 例：紫外线诱变的分子基础 紫外线诱变的操作步骤 青霉素生产菌的诱变育种 菌株 NRRL-B25 的诱变过程 Strain Mutagen Yield (U/ml) Time NRRL-B25 250 1943 NRRL-X1612 X-rays 500 1943 NRRL-Q176 UV light 850 1945 NRRL-WIS-47-1564 UV light 850 1947 --- --- 50000 1977 对早期生物技术的发展贡献巨大； 适用于途径或基因未得到研究的菌株； 产生的变异程度相对较低； 变异的位点及性质不明； 没有相应的基因就不可能发生新功能。 诱变育种技术的特点 二、DNA重组技术的发展 1. 限制性核酸内切酶 2. 逆转录酶 3. DNA连接酶 4. DNA聚合酶和聚合酶链式反应 1. 限制性核酸内切酶 20世纪60年代末Arber 等发现细菌能够产生识别特定的DNA序列并对其加以切割的酶，即限制性核酸内切酶，简称DNA内切酶。这个发现标记着DNA重组技术的诞生。 工具酶识别序列是4～8个核苷酸，这些位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回纹结构. 图7.18.(a) 限制性核酸内切酶的切割方式 粘性末端：两条单链上的断裂位置交错且对称，所产生的两个末端含有单链的互补序列。 平端切割：两条单链上的断裂位置处在一个对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等。 XhoI SciI 图7.8. 限制性内切酶切割方式实例 （b）、（c） 2. 逆转录酶 逆转录酶是以RNA为模板合成序列与其互补的DNA链。1970年，科学家发现逆转录病毒以逆转录酶合成它们RNA基因组的DNA拷贝。 以5′→3′方向合成DNA ，前提条件：有一段引物、一条模板分子、四种脱氧核糖核苷酸、镁离子。 3. DNA连接酶 DNA连接酶是一种能够催化DNA中相邻的3′-OH和5′-磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的一种酶。 1972年，David Jackson等使DNA片断的粘性末端退火（即碱基彼此配对），然后用DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与外源DNA的连接技术，成功地获得了重组DNA分子。 4. DNA聚合酶和聚合酶链式反应 DNA聚合酶在有一条DNA单链为模板和一段寡核苷酸为引物的条件下，催化与模板互补的另一条DNA新链的合成反应。1985年Kary Mullis等用DNA聚合酶创建了聚合酶链式反应(PCR)；用该技术进行特定DNA片段的体外扩增，可以在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝。 由于PCR技术对现代生物技术发展的巨大贡献，发明人获得了诺贝尔奖。 来自极端微生物的 热稳定性 DNA polymerase 如来自 Thermus aquatcus 的 Taq polymerase 95?C，半衰期 2 h 使PCR实现自动化。上图为PCR仪，下图为示PCR循环。 T (?C) 90 70 50 Time (min) 循环 1 循环2 循环3 循环 三、基因工程 1. 基因工程总体策略 2. 目标基因的克隆与鉴定 3. 宿主和载体 4. 重组蛋白的生产 1. 基因工程总体策略（1） 基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。 基因工程总体策略（2） 重组蛋白的生产 品种、菌株改良 遗传基因分析 5. 真核生物基因转录的调控 真核生物基因表达的调控作用可能发生在转录、mRNA修饰和稳定、翻译、mRNA的转运和降解等各个步骤。