丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验.doc

丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及稳定性分析 6.1 丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及结构鉴定 丹参酮IIA磺酸钠原料在生产和储存过程中都会出现稳定性问题，如酸性增强、含量降低等现象，质量标准中监控其相关物质成为必要，提供高纯度的相关物质对照品成为很大挑战。随着药品质量标准提高，ICH要求尽可能提供单杂大于0.1%的相关物质结构和可能的产生机制，构效关系和药理毒数据等。因此我们从丹参酮IIA磺酸钠原料生产过程中的精制母液中分离纯化获得相关物质，并和丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质进行HPLC对照，再通过LC-MS和1H-NMR分析，最终确定其结构。 Baolin Wang 等从丹参酮IIA磺酸钠原料中通过色谱分离纯化、LC-MSn和NMR鉴定推测出八种相关物质；Qiaogen Zou等从丹参酮IIA磺酸钠 原料中通过色谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出六种相关物质。而其磺化过程中的副产物和杂质成分研究还不够完善，我们通过制备液相技术分离纯化丹参酮IIA磺酸钠精制母液中的组分，寻找确定丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，分别确证为丹参酮IIB磺酸钠（2）、丹参酮I磺酸钠（4)\紫丹参甲素磺酸钠（5/6），其中4已作为药典标准中的杂质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），但2和5/6尚未见有文献报道得到纯物质。[1,2] 6.1.1 仪器与原料 Varian SD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱LL4001,1 inch.×25cm，色谱柱4002 ,2inch,×25cm；孔径12nm粒径5μm色谱填料ODS-AQ100g，理论工作压力1500psi，YMC;孔径12nm粒径10μm色谱填料PLRP-S150g，理论工作压力650psi，Angilent Technologies；Waters2695/2489高效液相色谱仪；色谱柱Angilent Extend C18 5μm，4.6×15cm；400M核磁共振波谱仪，NMR Avance III 400MHz，瑞士公司；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪，ACQUITYTIMUPLCQ-TOF MS Premier，USA Waters公司。 丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液（自制）；纯化水；甲醇，HPLC,Tedia、Fisher Scientific 和Merk；三乙胺（TEA),HPLC,Tedia。 6.1.2 方法 6.1.2.1 样品前处理 丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液进行相关物质富集前先在37℃条件下减压旋蒸结晶后滤纸过滤在经过0.22μm有机相微孔滤膜做过滤除菌处理。 6.1.2.2 富集和进一步纯化 选用装填PLRP-S聚合物填料的Varian LL4002色谱柱。实验体系为甲醇/水，20%～80%梯度洗脱，流速为100mL/min，检测波长为271nm。根据紫外检测结果实时收集样品。 6.1.2.3 二步纯化及精制 选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianLL4002色谱柱。实验体系为0.1%TEA-甲醇/0.1%TEA-水，20%～60%梯度洗脱，流速为25mL/min，检测波长为271nm。根据紫外检测结果实时收集样品。 6.1.2.4 HPLC检测 在富集、纯化精制过程中采用HPLC方法对样品组成及含量进行全程监测。HPLC监测体系为：Agilent Extend C18，5μm，4.6*150mm,流速为1mL/min，检测波长为271nm。 6.1.2.5冻干 经HPLC检测纯度98%的样品进行冻干保存。 6.1.2.6结构鉴定 将完成冻干的样品，进行LC-MS和1H-NMR检测。 6.1.3结果与讨论 6.1.3.1丹参酮IIA磺酸钠原料与精致母液的相关物质组成 图1丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测图谱 丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测结果见图1。根据图中结果显示，丹参酮IIA磺酸钠原料中含有5%左右的总杂含量，主要包含了六中相关物质（编号1,2,3,4,5,6)，其保留时间分别为13.122min，13.474min，15.576min，17.139min，19.196min及19.433min。其中，4为已确认的丹参酮I磺酸钠，并作为药典标准中的相关物质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），而其余相关物质药典中尚未提供相对关照品。 为简化相关物质的富集工作，采取从车间精制母液中富集提取相关物质的方法。丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测结果见图2。图中结果显示，精制母液中含有保留时间为13.495min（a）和19.122（b）的相关物质，其含量分别为15.6%和32.6%，远高于