免疫印迹SOP.doc

免疫印迹技术（Immunobloting） SOP 免疫印迹从早期用抗体直接“着染”聚丙烯酰胺凝胶内的蛋白（Burridge 1976;Showe 等1976）发展为现如今使用多样化复制技术的方法。对于仅有50多年历史的分子生物学来说，30岁的免疫印迹，即“Western Blot”可谓“古老”。尽管它存在这样那样的问题，但仍然广泛应用于多种基因功能、转基因检测等实验中。命名为“Western Blot”，与“Northern Blot”一样，完全源于科学家的幽默。在一次鸡尾酒会上，某人（现在已无人考证）开了这样一个玩笑，所有人都笑了，这个命名就这样延续了下来。咱们书归正传，下面让我们来介绍一下本实验室的Western Blot的实验流程、注意事项以及一点点心得体会。 一、样品制备 （一）鱼血清样品制备 1.将冻存后的鱼血清4℃融化。 2.血清10000r/m，5min，离心，取上清和（2×）loading buffer等体积混匀。 3.沸水煮样，3-5min，10000 r/m，5min，离心，取上清上样。 （二）细胞样品制备 1.取细胞3000 r/m，5min，将细胞用PBS洗三遍。 2.将细胞样品和（2×）loading buffer等体积混匀。 3.沸水煮样，3-5min，10000 r/m，5min，离心，取上清上样。 （三）组织样品制备 1.在组织块中加入少量的液氮，快速敲击，将组织研碎，少量液氮，反复几次。 2.边加液氮，边加（2×）loading buffer细胞裂解液，继续研磨，4℃放置一会,待buffer变回液体状，回收。 3.沸水煮样，3-5min，10000 r/m，5min，离心，取上清上样。 （四）注意事项 1.由于日本七鳃鳗血清中含有大量的胶原蛋白，如果不将其去除会对后面的实验以及Co-IP都会产生很大的影响，所以在煮样前先将其10000r/m离心，取上清，去除胶原蛋白。 2.处理细胞时一定要将细胞清洗干净，因为用来培养细胞的培养基或是冻存液中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，若直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46 kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。 3.样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有:①再煮5min。②1ml用注射器反复吹打。③再就是超声破碎，要注意超声破碎的条件，超声时间不易超过5min，停顿时间要长于超声时间，总的超声时间要依据样品量以及样品的粘稠程度而定，若不是很粘稠，1min即可。（从经验看，超声的效果要好于注射器吹打的效果） 二、蛋白电泳 电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆，这里就不一一赘述。本实验室采用 JM-250型蛋白电泳仪，浓缩胶采用86V，分离胶采用156V。 注意事项： 1. 30%聚丙烯酰胺会降解，要4度避光保存。 2.配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。 3.上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。 4.增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，增强目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。 5.如果第二天实验时间比较紧张可提前将SDS PAGE胶配好，放于大的自封袋中，将空气赶出并封死，放于4℃过夜。（关于这点，网上众说纷纭，也有说放于常温即可，4℃低温可能导SDS析出，不过经过实践检验，我们的做法并无大碍） 6.在跑长时间的电泳时，电泳往往会产生大量的热量，这时要想办法给胶散热，否则条带变形。 三、转印 转印可分为湿转和半干转，本实验室采用的是半干转，下面的描述主要是针对的是