免疫荧光技术交流.doc

免疫荧光 （所有的步骤仅为个人意见，仅供参考） 从切片完成之后开始 免疫实验荧光器材 避光场所，湿盒，烘箱等加温设备，吸水的纸，移液枪，1.5ml EP管，微波炉，抗原修复用的容器，ph试纸或ph仪，盖玻片，多聚赖氨酸包被的载玻片等 免疫荧光实验试剂 一抗 荧光二抗 Hoechst 33342（与双链DNA结合，显核，蓝荧光） 抗体稀释液（含1%BSA的PBS） 10×PBS（NaCl 42.5g,NaH2PO4·2H2O1.482g, Na2HPO4·12H2O 14.5055g,定容至500ml，配完最好高压灭菌一下）。 PBS（10×PBS稀释10倍，再调ph至7.2-7.4。用得可快了）。 10×柠檬酸盐抗原修复液（C6H8O7·H2O2g， Na3C6H5O7·2H2O11.8g，定容至500ml，配完最好高压灭菌一下）。 柠檬酸盐抗原修复液（10×柠檬酸盐抗原修复液稀释10倍，再调ph至6.0）。 封片剂（0.672gNaHCO3加40ml蒸馏水（其为0.2mol/L），以1mol/L的NaOH调其ph至9.0左右（ NaOH 加0.75ml左右吧）。吸取1ml此液体，与1ml 100%甘油混匀即可） 蒸馏水 免疫荧光程序： 包埋好的标本用切片机切石蜡切片(2微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上（可购买，我用的是北京中衫的，从不掉片）。 经60℃烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。 二甲苯Ⅰ脱蜡4分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃），二甲苯Ⅱ脱蜡6分钟。 梯度酒精复水：100%酒精1分钟，95%酒精1分钟，75%酒精1分钟（这个梯度是没问题的，而且都是现成的医用酒精，不用配制），蒸馏水2分钟，PBS 2分钟×2次。 进行抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟（我想还是煮沸6分钟×4次更好）。 PBS浸洗2分钟后滴加0.3%tritonX-100透膜剂透膜12分钟（不透膜也没关系，反正细胞早就被切开了）。但注意细胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100，否则会被洗掉。 用PBS 2分钟×2次洗去透膜液，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（无色的10%FBS或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37℃封闭30分钟（室温30分钟也可）。 用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜（37℃1小时多也差不多），再用PBS 3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。 滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1-1.5小时，此时可在荧光显微镜下迅速观察是否着染，以确定终止时间。用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。 滴加 Hoechst33342 避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS 1分钟×3次洗去Hoechst 33342，用滤纸擦去标本外的PBS。 最后用含抗荧光淬灭剂的封片液碧云天封片（可自配），并在荧光显微镜下立即观察。 照相后可用photoshop将同一视野下不同的荧光图像叠加，效果不错，有一篇参考文献支持。 ▲注：若一张切片同时做两种抗体的免疫荧光，则加一抗时可将两种一抗按各自所需的浓度混合，但要注意抗体要来源于不同的动物。加二抗时也可将两种二抗按各自所需的浓度混合，但要注意二抗要有不同的颜色。 1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；? 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min? 抗体染色：– C孵育30min；(在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37? 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。? 缓冲甘油封片– 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ? 镜检：在荧光显微镜下观察。? 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。? 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事项(? 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；? 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。? 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；– 染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；– C的低温，延长染色时间。(C可加强染