第十七章：植物基因工程汇总.ppt

转化率影响因素： 金属微粒：金粉颗粒比钨粉颗粒性质优良，但价格昂贵； DNA沉淀辅助剂：对DNA在微粒上的黏附有重要作用，但对植物受体细胞也产生一定的伤害； DNA的纯度及浓度； 微弹的速度； 植物材料内在因素。 脂质体介导的基因转化 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用，偶尔也通过渗透作用，将DNA传递进入细胞。 脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体。 适用性广，转染效率高，重复性好，转染效果随细胞类型变化大，操作繁琐，技术含量高。 微激光束法 将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的DNA流入细胞，实现基因的转移。 操作简便、工作效率高； 无寄主限制，适应于各种动植物； 对受体细胞生命活动影响小； 受体的类型广泛； 用于细胞器的基因转化。 花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入囊胚，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期的胚体细胞。 农杆菌介导法 Ti质粒的遗传特性 章鱼碱型（octopine） 胭脂碱型（nopaline） 农杆菌素碱型（agropine） 琥珀碱型（succinamopine） 野生型农杆菌的Ti质粒 野生型农杆菌的Ti质粒的缺点 质粒过大，操作困难； 大型的Ti质粒有多个酶切位点； 植物激素类的影响； Ti质粒中存在不起作用的序列； Ti质粒的局限性。 将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 野生型农杆菌的Ti质粒的改良 农杆菌转化的影响因素 农杆菌的菌株 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期 基因活化的诱导物 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种和共培养 农杆菌转化的特点 低拷贝整合（多为单拷贝整合），转化效率高； 存在宿主范围的局限性 第六节 转化子细胞的筛选 植物基因工程中的选择基因 主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因 新霉素抗性基因（neor） 庆大霉素抗性基因（gentr） 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar） 常用的植物基因工程选择基因 新霉素抗性基因（neor） 新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成。G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中蛋白质的合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。 庆大霉素抗性基因（gentr） 庆大霉素抗性基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt） 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过使潮霉素磷酸化而使其失活。 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar） 该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂是膦丝菌素，膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。 植物基因工程中的报告基因 报告基因是指其编码产物能够被快速测定，常用于判断外源基因是否成功地导入外源细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。 它的应用不依赖于外界的选择压力。 理想报告基因的基本要求 受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性； 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞； 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。 植物细胞全能性（totipotency）： 植物体细胞或性细胞，在人为控制的培养条件下都具有再生成新个体的潜能，因而在适宜的条件下可以被诱导生长形成完整植株。 已分化组织细胞 脱分化 分裂 器官 植株 组织 再分化 脱分化（dedifferentiation）： 在组织培养中，当把分化组织中的不分裂的静止细胞放在一种能促进细胞增殖的培养基上以后，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分裂状态。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化。 脱分化过程的实质是解除分化，逆转细胞的分化状态，使其回到分化前的原始状态，以恢复细胞的全能性。脱分化状态的细胞即是愈伤组织。 再分化： 离体培养的植物组织和细胞形成的处于脱分化状态的细胞（愈伤组织），仍可以再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整的植株，这一过程称为再分化。 植物细胞全能性的实现必需满足两个条件： 把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，使之处于离体的条件下---脱分化； 给这些细胞以适