第十三次课：单克隆抗体：从诊断到治疗汇总.ppt

HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 （四）杂交瘤细胞的选择性培养 应用液： 8-氮鸟嘌呤 HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径） T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA。H和T联合阻断DNA合成的替代途径。 HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡。DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡。HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径被阻断 SP2/O: HGPRT- ，TK-;　长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命 骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞 杂交瘤细胞特点： 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力 有限稀释法(limiting dilution) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method) 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。 效率最高 价格昂贵 FACS（ ?Fluorescence Activating Cell Sorter ） 软琼脂平板法(soft agar method) 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天 克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。 吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮?保存数年至数十年 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 （1）单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56； B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 免疫扩散 ELISA C、单抗纯度的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫 转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS、IEF、WB （三）单克隆抗体的性质鉴定 （2）单抗理化特性的鉴定 抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。 常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等 （3）单抗与相应抗原的反应性测定 包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等 三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细