脂肪细胞分化方法3T3-L1DifferentiationProtocol.doc

3T3-L1 Differentiation Protocol Step 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。 Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。 诱导液I：0.5m M IBMX; 0.25 μM 地塞米松； 1μg/ml insulin; 含10% FBS 的DMEM-F12。 Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。 诱导液II： 1μg/ml insulin; 含10% FBS 的DMEM-F12。 Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。 Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。 Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。 这样的条件下 ≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。 Step7: Oil Red O staining 鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或 4% paraformaldehyde 室温固定30 min。固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。 Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。 取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。 Step8: 获得结果并进行后期处理。 Other protocol can be used: 美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细) 3T3-L1 Differentiation Protocol MATERIALS Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate) Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEM Isobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) SOLUTIONS 10% Calf Serum/DMEM 60mL Calf Serum 6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate 6mL 100x P/S/G 500mL DMEM 10% FBS/DMEM 60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized) 6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate 6mL 100x P/S/G 500mL DMEM IBMX Solution (make fresh) a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL. b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter. Insulin Stock Solution 167 uM (1mg/mL) in 0.02M HCl Filter sterilized through 0.22 mm filter Can store at -20C for long term,