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第二章 基因工程的酶学基础 本章节内容 本章学习内容 重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。? 第一节 限制性内切核酸酶 1. 来源 （1）限制（Restriction） （2）修饰（Modification） （3）限制与修饰系统相关的三个基因 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性 （2）切割位点 2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性 （2）切割位点 （3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能 （4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割 3. Ⅲ类限制性内切酶 核酸限制性内切酶的类型及主要特性 四、限制性内切酶酶解反应条件 2. 酶解过程 配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定 ① 酶解体系 ② 混匀 ③反应终止 ④ 酶解结果鉴定 酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带 酶存在“星号”活性，造成非特异性切割； 不正确的操作，导致其它内切酶污染； 底物DNA中可能存在其它DNA污染。 （1）内切酶与识别序列的结合模式 （4） 几种常用限制酶识别位点 ① 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液 ④ 酶分装成小份，避免反复冻融 五、影响限制性内切酶活性的因素 需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) ① 在相同的缓冲液中反应同时进行 练习题 何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点 什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？ 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【 】Ａ 修复自身的遗传缺陷 Ｂ 促进自身的基因重组 Ｃ 强化自身的核酸代谢 Ｄ 提高自身的防御能力 Ｅ 补充自身的核苷酸消耗 第二节 DNA 连接酶 二、DNA ligase的特点 2. 连接条件 三、连接反应的机理 如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端 ？ 四、连接反应的温度 五、影响连接反应的因素 六、DNA连接的反应体系 酶切纯化后的DNA片断 连接缓冲液 DNA连接酶 七、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 第三节 DNA聚合酶 二、常用的DNA聚合酶的特点 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 （3）用DNA聚合酶Ⅰ制备探针 ② 探针的标记方式 ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 2. Klenow fragment （2）主要用途 ③ cDNA第二链的合成 3. T4 DNA聚合酶 ③ 特点 （2） T4 DNA聚合酶的用途 a. 放射性标记的优缺点： b. 非放射性标记 利用切口转移法将生物素掺入DNA探针中 ii）地高辛标记： 4. T7 DNA聚合酶 （2）T7 DNA聚合酶的特点 （3）T7 DNA聚合酶的用途 5. 修饰后的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 （3）逆转录酶的用途 第四节 DNA修饰酶 4. 末端转移酶的用途 （2）再生酶切位点 （3）DNA3’－OH末端标记 二、T4多核苷酸激酶 3. 多核苷酸激酶的用途 三、碱性磷酸酶 2. 碱性磷酸酶的特性 第五节 核酸外切酶（ Exonucleases） 二、双链DNA外切酶 2. ?核酸外切酶（? exo） 3. T7基因6核酸外切酶 第六节 单链DNA内切酶 3. S1核酸内切酶的功能 4. S1核酸酶的用途 （2）用mRNA测定基因中的外显子序列 二、Bal 31核酸酶 4. Bal31的用途 Bal31控制消化法： 第七节 RNA酶 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程，形成地高辛标记的DNA探针。 生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。 地高辛的结合物是抗地高辛抗体。 （1）来源 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： ① T7噬菌体基因5编码的大亚基： T7噬菌体5蛋白。 有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。 ② 大肠杆菌编码的小亚基： 硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。 ① 持续合成能力强 一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 ② 3’?5’