辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析.docx

辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析刘茂炎1,2 刘湘宁 李讯 张德咏 戴良英* 唐前君*收稿日期：2015年7月15日/接受：2015年11月15日/在线发表时间：2015年11月30日摘 要本实验的辣椒叶脉黄化病毒（pepper vein yellowsvirus，PeVYV）基因组序列（PeVYV-HN，登录号KP326573）是从湖南省蔬菜研究所（湖南长沙，中国）种植的辣椒植物（Capsicum annuum L.）上分离并通过深度测序sRNA获取的。该PeVYV-HN基因组由6244个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORF），和日本的分离物（AB594828）类似，同样其基因组结构与马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的其它成员类似。序列分析表明，PeVYV-HN与日本PeVYV基因组在核苷酸和氨基酸水平上都共享92％的序列同一性。基于其外壳蛋白（Coat Protein, CP）的，运动蛋白（Movement Protein, MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以分成对应于其地理来源的两个主要谱系。相对于非洲分离物，亚洲分离物相具有较高的种群扩张频率。负选择作用和遗传漂变（奠基者效应）被认为是潜在的PeVYV的分子进化驱动力。此外，重组不是PeVYV进化的明显因素。这是在中国PeVYV的完整基因组序列的第一份报告。关键词：辣椒脉黄化病毒; 深度测序；全基因组；分子进化马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），属于黄症病毒科（Luteoviridae）其代表品种马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV），当然也包括PeVYV[1–3]。其基因组为单分子线形正义/doc/366401-388123.htmlssRNA，包含大约6000个核苷酸（nt），在5端具有一个特异性蛋白（VPg）结构。基因组包含六个开放阅读框，ORF 0与ORF 1重叠，ORF 2与ORF 1重叠;ORF 4完全处在ORF 3之中。ORF 5编码76-kDa的通读蛋白，对蚜虫传播至关重要，也有可能是病毒颗粒的稳定因子。PLRV主要感染茄科的植物，是通过蚜虫传播。PeVYV是导致叶脉黄化病 ( yellow vein disease, YVD )的一个重要的病原体，其在西非是一种主要的辣椒病害[4]。1995年PeVYV首次在日本得到确定[5]. PeVYV通过蚜虫（Aphis gossypii）、嫁接等固定的方式传播[5]，对辣椒是一个世界性的难题，并经常在与其它病毒混合侵染中发现。PeVYV可以基于CP序列从其他的病毒容易地区别 [6-8]。辣椒被PeVYV侵染的主要表现症状有叶脉黄化，叶卷曲，叶片变形，叶褶皱和节间缩短等。PeVYV已经在印度，印尼，马里，菲律宾，西班牙，台湾，泰国，以及苏丹[2, 3]等国家和地区的辣椒作物上分离得到。最近，有个新的寄主，龙葵(Solanum nigrum)和在印度[3]得到了鉴定。这些表明，PeVYV具有广泛的地域分布，对辣椒以及其它植物构成全球性的威胁[3, 9]。日本分离的PeVYV核苷酸序列是储存在基因库（GenBank）仅有的全长序列（登录号AB594828），还有一些也可提供包括在CP，MP和RdRp 基因等部分序列，分别来自在亚洲的台湾，泰国，印度，印尼和菲律宾；在非洲的苏丹，马里和突尼斯; 以及在欧洲的土耳其和西班牙（表S2）。 然而，这些不同的PeVYV分离物的进化史是鲜为人知的 [10]。在2013年，有可能被病毒感染的展示植物矮化，叶片萎缩/畸形，脉间黄化，叶脉变黄，叶片卷曲，叶片褶皱和黄色斑块等症状的辣椒叶片从中国湖南省长沙市收集。病毒RNA是使用氯化锂法从这些辣椒叶提的[11]，全基因组序列是在Illumina NextSeq 500平台通过小分子RNA（sRNAS）深度测序法得到的。总共得读取点。低质量的读取数据（Q20），读取点包含N，并且读取数小于18核苷酸（nt）的，从数据集中移除。整理好的读取数据集，采用BOWTIE进行BLAST有哪些信誉好的足球投注网站处理， 以具有至少15个核苷酸和18-50 nt长度的5和3连接匹配作为标准。在miRBase数据库v.21.0中的初级转录物（pre-miRNA）和成熟miRNA进行BLAST（/BLAST）检索来识别的miRNA。使用RFAM（10.1）数据库(http://rfam.sanger.ac.uk/)除去非miRNA，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA。最后，在平均覆盖率达到超过100倍的情况下，PeVYV基因组用 V