光電比色检验基础知识.doc

光电比色分析仪的基本知识 概述： 北京普朗公司的现有主要产品都是体外诊断医用设备（IVD产品），在《医疗器械分类目录》中该类产品的管理类别是6840-Ⅱ类。其注册工作由省级或直辖市药监局管理。是医院、卫生防疫站、血站、妇幼保健站等临床实验室及食品安全、动物检疫及科研实验室对样本进行检验的仪器。 本公司现有主要产品属于光电比色分析仪器。仪器工作时检测到的原始信号是一个光信号，通过分析计算得到最终检验结果。因此光学系统的好坏对仪器的质量起着决定性的作用。下面首先介绍一下光电比色的基本知识。 一． 光电比色检验的基本知识 光电比色检验是指利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析方法。它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技术之一。 1.1 物质的溶液对光的选择性吸收现象 物质的溶液为什么会有颜色，人看到的不同颜色，是不同波长的光对人眼睛产生的不同视觉效应。 不同物质的溶液，只吸收与之对应的某个波长的光子能量，因此每种物质的溶液都有自己特定吸收光谱，即某种物质对某种波长的光有最大吸收（吸收峰），而对其他波长的光几乎不吸收或很少吸收，人看到的溶液颜色只是未被吸收的可见光。因为不同物质的溶液，只吸收不同波长的光，所以人眼会看到不同物质的溶液呈现出不同的颜色。 互补光：例如，紫（400~430）与绿(500~560)；兰(430~450)与黄(560~590)；青(480~500)与红(620~700)，互为互补光。如果看到的溶液是兰色，则溶液吸收的一定是黄色光。 紫外光：λ小于400nm 红外光：λ大于760nm d) 工作波长：为了提高仪器检验的灵敏度，应该选择待测物质的吸收峰波长作为检验波长，这样只要待测溶液中含有被测物质，就会对入射光产生明显的吸收（检测信号）。如果浓度变化，则会引起对入射光的吸收（检测信号）产生明显变化。 因此在上图中选择560nm波长作为检测波长，就容易测得C物质浓度变化引起的吸光度变化值，并依此计算出浓度值。 很显然如果需要检测A，B的浓度，则应分别选择390nm,470nm作为工作波长。 如果待测容器中既有A物质，又有B物质（伴随物），在需要检测A物质时，却选择了410nm作为工作波长，则必定受到B物质的干扰（因此时测得的吸光度值是A和B的总和）。 e) 单色光：为了减少其它物质对检测的干扰，检测波长的光谱范围应该越窄越好（但光谱范围越窄，在同一光源的情况下，获得的光能量会越小，信号会越弱）。在检验仪器中，一般利用干涉滤光片（一个滤光片只提供一种波长）或者光栅（可连续选出不同的波长）来获得高纯度的单色光。　　（为什么要选择物质的吸收峰波长作为工作波长？） f) 常用生化滤光片透射光谱曲线示例： 常用标准生化滤光片的主要波长有：340, 380, 405, 450, 480, 492, 505, 510, 546,578, 620, 630, 700nm 等；中心波长误差为：±1-3nm,半波宽度在6～12nm左右，最高透过率30%～60%（可视需要而选定）。 1.3． 朗伯-比耳定律： 如果不把吸光度和浓度建立起量的联系，仅有吸光度则没有任何临床意义。朗伯-比耳定律的创立，解决了吸光度与浓度量的内在联系，该定律是光谱化学分析的理论基础。 朗伯-比耳定律（光的吸收定律）：在一定条件下，当入射光一定时，溶液对光的吸 收程度与溶液的浓度及液层厚度成正比。 表达式如下： A=K·C·L （1） 其中：A—吸光度；K—吸光系数；C—溶液浓度； L—液层厚度（光在溶液中走过的路径）。 当液层厚度为1cm ，浓度单位为1mol／L 时，吸光系数K称为摩尔吸光系数，用ε表示。ε是物质的特征性常数。 该定律的下列形式，为应用朗伯-比耳定律提供了方便： （2） I0 It 其中：Io：入射光信号强度；It ：透射光信号强度。 仪器只要分别测得入射光信号和透射光信号，就可利用（2）式计算出待测液的吸光度。 除了溶液的浓度和温度以外，影响朗伯-比耳定律正常应用的主要仪器因素有： 1.3.1 仪器信号不稳定产生的误差（随机因素）：Io和It在仪器上一般是分时测定的（双光路可同时检测Io和It），必须确保在测定It时，Io保持不变