从活细胞中纯化DNA.ppt.ppt

* Three distinct kinds of DNA are needed to be prepared: total cell DNA; plasmid DNA; phage DNA. 3.1 全细胞DNA的制备 全细胞DNA是目的基因的材料来源，因此是必须得到的。我们通过学习细菌的全细胞DNA的制备，来了解DNA制备的基本知识。随后，我们再讲解质粒和噬菌体DNA的制备过程。 从细菌培养物中制备全细胞DNA的步骤： （1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞的破碎及内含物(content)的释放； （3）从细胞抽提物（cell extract）中除去DNA外的其他所有成分； （4）DNA溶液的浓缩(concentrated)。 3.1.1 细菌培养物的生长和收集 培养细菌需要培养基（culture medium），M9和LB培养基是两种典型的细菌培养基。 M9是一种确定成分培养基（defined medium），其中的所有成分是可知的。这种培养基包含的无机营养成分（inorganic nutrients)的混合物为细菌的生长提供基本元素，如氮，镁和钙，葡萄糖(glucose)提供碳源和能量。在实际应用中，还必须向M9中添加额外的生长因子，如微量元素和维生素。需要添加何种成分要视情况而定。 Luria-Bertani（LB）培养基是一种不确定成分培养基(undefined medium)，胰蛋白胨(tryptone)负责提供氨基酸以及小的肽段，酵母提取物(yeast extract)负责提供氮源、糖以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基不需要补充其他的营养成分，并且能够维持种类更多的细菌的生长。 当细菌培养物需要在严格准确的条件下进行生长时，必须使用确定成分培养基。然而，当培养物仅仅作为一种DNA的来源时，就没有必要用确定成分培养基，利用不确定成分培养基就更加合适。 利用LB培养基，在37 ℃、150～250 r/min的条件下，培养大肠杆菌细胞，大约每20 min分裂一次，直到培养基中的细胞达到2×109～3×109个/mL的最大密度。培养物的生长状况可以通过读取600 nm可见分光光度值（OD值）来监测，在该波长下，每个单位的OD值相当于0.8×109 个/mL。 通过离心可以收集细胞。相对较低的转速就能够使细菌在离心管（centrifuge tube）的底部聚集，这样一来上层的培养基就能够很容易到出。 3.1.2 细菌提取物的制备 制备细胞提取物的第一步是使细胞裂解。裂解细胞的方法大体上可以分为两类：物理方法和化学方法。物理方法指的是以机械力(mechanical forces)的方法破碎细胞来释放内涵物。化学方法则是用化学药品(chemical agents)对细胞进行破碎。在制备DNA时通常以化学的方法破碎细胞。 在制备DNA时通常利用化学方法去破碎细胞。所使用的试剂通常包括一种能够破坏细胞壁的成分和一种能够去除细胞膜的成分。对于大肠杆菌来说，常常使用溶菌酶(lysozyme)或者乙二胺四乙酸盐（EDTA）破坏细胞壁，或者二者结合起来使用。溶菌酶是一种在鸡蛋清中存在的酶，它能够消化掉细胞壁中的多聚物。EDTA能够通过螯合除去对保护整个细胞外壁来说必不可少的钙离子，同时抑制细胞质中降解DNA的酶。在某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁足以导致细胞破裂，但通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）导致细胞膜破裂，协助整个细胞外壁的溶解过程。 制备细胞提取物的最后一个步骤是通过离心去除细胞内的不溶性残余物。像部分消化的细胞壁碎片等成分能够通过离心的方式聚集在离心管的底部，而细胞提取物则以上清（supernatant）的形式得到分离。 3.1.3 从细胞提取物中纯化DNA 除了DNA，细菌提取物中还包含有大量的蛋白质和RNA，因此，要除去这些多余的成分后，才能得到纯净的DNA。 去除蛋白质的标准方法：加入苯酚和氯仿的混合物（1∶1）（phenol / chloroform ）。混合物能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸（DNA和RNA）在水溶液中。把细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂的界面处形成白色的凝集物。这样一来，水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。 如果细胞提取物中的蛋白质过多，单用苯酚提取并不足以彻底纯化核酸。这时需要需要在苯酚抽提前，先用蛋白酶（proteinase），比如蛋白酶K，对细胞提取物进行处理，这些酶可以将蛋白质降解为短肽便于进行苯酚的提取。 一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数RNA