分支杆菌培养技术资料.ppt

* 目的： 分离培养临床标本中的分枝杆菌 意义： 诊断结核病金标准 获得菌株鉴定试验纯培养物 获得药敏试验所需的纯培养物 疗效评估 分类： 简单法:酸性罗氏培养法 离心集菌法：中性罗氏培养法、液体培养法（如MGIT960液体培养法） 专性需氧菌 最适生长温度为37℃ 最适PH为6.5～7.2 营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子 生长缓慢：在一般培养基上分裂一代需要18-24小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。 菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明 （ 液体培养基：絮状或颗粒状沉淀。） 痰标本2-3ml 1－2倍 4% NaOH 振荡匀化 静置15分钟 均匀接种0.1ml,2支 斜面朝上，放置24小时 37℃，培养8周 1、原理 2、标本类型 3、仪器设备 4、试剂耗材 5、操作注意事项 6、结果判读 7、质量控制 8、讨论 分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长 2%NaOH 4%NaOH 4%H2SO4 注：不同浓度消化处理液对结核菌生长的影响 痰、BF、体液（胸腹水、尿液、CSF等）、大便、组织等 注： 标本是否留取合格 不同标本类型的不同前处理过程 保存方法 1、II级生物安全柜 2、恒温培养箱 3、漩涡振荡器 4、冷冻离心机 5、天平 6、高压灭菌锅 1、 4%NaOH 2、酸性罗氏培养基成分 味精（谷氨酸钠）（纯度95%以上）7.2g KH2PO4 14 g (中性2.4g) 枸橼酸镁 0.6 g MgSO4·7H2O 0.24 g 甘油（丙三醇） 12ml 蒸馏水 600ml 新鲜鸡卵液 1000ml 2%孔雀绿 20ml 85 ℃蒸气锅50分钟 注：配制培养基需注意的问题、注意识别不合格培养基 视痰标本性状，加l～2倍体积4％氢氧化钠(Na0H)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡2～3分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟。样本数较多时，应分批处理。 吸取经前处理后的痰液0.1毫升，无菌操作均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37℃平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37℃继续培养。 分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长。 分枝杆菌培养阳性(1十)：菌落生长占斜面面积的1／4。 分枝杆菌培养阳性(2十)：菌落生长占斜面面积的1／2。 分枝杆菌培养阳性(3十)：菌落生长占斜面面积的3／4。 分枝杆菌培养阳性(4十)：菌落生长布满全斜面。 分枝杆菌培养阴性应以 “(培养阴性)”报告，不能以“(—)” 表示。菌落生长不足以斜面面积1／4时， 实报菌落数。 （对可疑培养阳性标本，必须涂片进行抗酸染色确诊） 注：培养的第3天，之后每周记一次结果，对可疑的分支杆菌需涂片进行抗酸染色 室内质量控制（QC） 室间质量评估（EQA） 现场评价 (on-site evaluation)：人力物力，难以日常监控 盲法复检 (blinded-rechecking)：痰标本用完难以重复 批量测试 (panel testing)：在样本准备方面还需要更多的技术投入 培养的质量保证目前主要依赖室内质量控制，辅以定期或不定期的现场评价。 室内质量控制 人员培训、仪器设备监控、培养基无菌试验、生长试验 每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阳率和污染率的统计分析 涂阳培阳率 公式: 培养阳性的病例总数 ———————————————×100% 涂片检查阳性并进行培养的病例数 初诊病人涂阳培阳率应大于90％ 污染率 公式: