PCR质控及问题分析.ppt

PCR质量控制及常见问题分析、对策 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 临床检验技术历经了 一、化学试剂检验 二、酶促生化检验 三、抗原-抗体免疫反应等三个主要技术阶段 四、近年来人类基因组计划的完成也推动了临床检验进入基因检测-分子诊断时代 血糖 检测 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 一? PCR技术最根本特征 二? PCR系统外的质量控制 三? PCR体系内的常见问题、原因分析及对策 1.传统诊断: 靶A+试剂B 信号C, 均为信号相加模式。 2.PCR: 1,2,4,8------230(109)--- 2n -----靶分子指数增加模式。 PCR极高扩增放大倍数亦带来非特异性过度放大! 1. 硬件建设: 2. 软件控制: 标准操作SOP, 人员操作培训,质量追踪体系。 分室/分区实验室, 安全柜,仪器,螺盖管/胶膜96孔板, PCR反应液加矿物油封闭,UDG酶消除气雾胶。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. PCR体系问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 临床PCR检测的常见问题 实时荧光PCR定量检测的关键问题 PCR体系内的常见问题、原因分析及其对策 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加 引 物 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体PD 完整性 避免反复冻融 浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 反应体系对PCR扩增的影响 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 pH值适当 避免污染 pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 反应缓冲液 dNTPs dH2O Mg 2＋浓度 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 Taq酶 pfu酶 Hotstart Taq酶 混合酶 Taq plus Long Taq Taq platinum Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 特异性-----基因组扩增、RT-PCR 保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测 如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实