基因工程复习内容整理素材.doc

第二章 基因操作的主要原理 1、核酸凝胶电泳的原理及分类？ 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的分子具有更紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。 分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。 2、影响DNA迁移率的因素有那些？ DNA分子量大小；DNA的构象；凝胶的浓度。 3、EB的作用原理。 一种具扁平分子的核酸染料，可插入到DNA或RNA分子的碱基之间。在300nm紫外灯照射下发射出荧光。 4、核酸分子杂交所依据的原理是什么？有那几种杂交方式？ 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 杂交方式有:DNA/DNA印迹杂交——Southern Blotting；RNA/RNA印迹杂交－Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落或噬菌斑杂交。 5、细菌转化的技术方法。 原生质体转化法、化学转化法、电穿孔法。 6、Sanger的双脱氧链终止法的技术路线？ 利用了DNA聚合酶的两种特性：第一，它能够利用单链的DNA做模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷酸做底物，使之参入到寡核苷酸连的3’末端，从而终止链的生长。 技术路线：见书 7.化学修饰法的技术路线：见P71，参考技术图 8.PCR的原理： 双链DNA分子在高温下解链成两条单链DNA，然后DNA聚合酶在有一对寡核苷酸引物的存在的情况下，以单链DNA为模板利用反应混合物中的dNTPs合成新生的DNA互补链。并且，每一条新生链上都具有了新的引物结合位点。然后反应混合物再经过上述过程，即可有合成新链。如此反复循环，即可实现特定区段DNA的迅速大量扩增。 9.简并引物：一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。 Taq聚合酶：有5’(3’DNA聚合酶活性；无3’(5’外切酶活性；最适聚合酶温度72℃，连续保温30min具有相当活力，选择72℃延伸；变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性。 Pfu聚合酶：耐热；有5’(3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；精确度：pfu Taq，但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 10.盒式取代诱变的原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列。这种寡核苷酸盒是由两条合成的寡核苷酸组成的，当它们退火时，会按设计要求产生出需要的粘性末端。 Kunkel定点诱变：① 将待突变的基因克隆入RF-M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung-）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。② dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点诱变。③ 双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。 重组PCR定点诱变：详见P98 11.凝胶阻滞实验原理：DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合。 竞争DNA的作用：反应体系中加入超量的非标记竞争DNA，用于研究DNA与蛋白质作用的专一性。 12.DNaseI印迹试验原理：详见P115，参考技术图 13.甲基化干扰试验原理：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。 第三章 1、限制性内切酶识别DNA的特点？什么是同裂酶，什么是同尾酶？ Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大； Ⅱ型酶（狭义的限制性内切酶）：分子量较小（105 Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上