基因表达沉默技术分解.ppt

药学系药物基因组学教研室 2010.06.18 教学内容及要求 参考资料 《基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册》，北京大学出版社，静国忠编 自备材料（个人实践经验） RNA 干扰 (RNA interference, RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 小干扰RNA: 具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA)。 随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。 1）靶序列的调出 2）利用免费设计软件进行siRNA设计 软件的选择原则 1、选择可读框内、翻译起始位点之后50～100nt的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA； 3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右； 4、碱基数目控制在19～21nt； 5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。 3）siRNA合成或表达 4) siRNA working? 5)合成or构建载体？ 1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。 Tysabri 核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的RNA，化学本质是RNA,却具有酶的催化功能。  小结 感想 1.意外=Key 2.科研选题：follow or create? 3.Pure scientist 作业 silence 1个死亡病例和1个产生严重中枢神经系统副作用的病例，公司决定暂时中止Tys abri的销售 the first generation phosphorothioate backbone modification 磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子。PS DNA ON的主要缺点是能与一些蛋白结合，这可以引起细胞毒性。另外一个缺点是与互补RNA的亲和性会稍微降低 第二代寡聚核苷酸在核糖的2位置含有烷基修饰。2-O-甲基和2-O-乙基是这类修饰的两个重要成员。具有这种修饰的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，并且与互补RNA的亲和性也得到了稍微提高。然而这些有利的性质被2-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA这个缺点所抵消 怎样筛选实现了同源重组的ES细胞呢？ 胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。 马里奥·卡佩基(Mario .Capecchi),马丁·埃文斯(Martin J.Evans)和奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)从各自不同的研究角度使这项技术成为可能 每年 科研工作者的经验总结：学者根据经验建议：寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点，较易取得干扰成功 。 胸腺嘧啶激酶 核酶可特异性地切割靶RNA序列的特性。被科学家拿来进行基因功能和基因治疗研究。 以锤头状核酶为例，学习如何设计针对靶mRNA的人工核酶 再来回顾一下RNAi的发现历史。1995 年，康奈尔大学Su Guo 博士，在试图利用反义RNA 技术阻断秀丽线虫par-1 基因时，发现了实验对照正义 RNA 也能阻断par-1基因的表达。 困惑…… 通过实验阐明了这一反常现象：将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽线虫比单独注射反义RNA诱导基因沉默效率高10倍。由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平(Fire等，1998)。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗研究领域。在座各位十有八九也要进行siRNA实验设计。 怎样进行siRNA设计？ 设计的siRNA是什么样？看看天然siRNA分子是什么样，就会一目了然。 长度 悬端 瞬时；长期：构建siRNA针核表达载体-转染细胞-稳定表达克隆 谁来启动siRNA表达呢？ 如何进行siRNA基因设计和克隆？举例说明 反向互补序列 siRNA实验设计…… 形成双链抑制翻译………;反义mRNA 核酸在体内易被降解，研究人员……. 感兴趣的同学可上网 反义核酸药物上市？ 用于在动物水平研究基因功能….. 对高度分化的细胞进行基因敲除，这些高度分化的细胞没有发育成组织器官或个体的能力；而对ES细胞进行基因敲除，这些全能性则有发育成组织器官或