07基因工程.pptx

第七章 基因工程Genetic Engineering陈耕夫生物化学与分子生物学系基础学院 广东药学院主要内容一、基本概念二、基因工程相关的酶学三、基因工程的载体四、目的基因的制备五、载体DNA与目的基因的连接六、重组分子引入受体细胞七、重组体的鉴定和分析八、克隆基因的表达系统策略【自学】九、重组原核微生物生产药物一、基本概念（一）基本概念重组DNA技术：是采用各种酶将各种外源的DNA进行体外的切割与拼接构成DNA嵌合体的技术。分子克隆：是指将作为供体的重组DNA分子置于与其毫无亲缘关系的受体（宿主）细胞内复制（扩增）的过程，又称为基因克隆、基因的无性繁殖。一、基本概念（一）基本概念基因工程：是将不同的生物基因（供体）在体外人工剪切、组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后、引入原先没有这类基因的微生物或细胞（受体）内进行扩增，使转入的基因在细胞内高效表达，并合成该基因所编码蛋白质的过程，又称为基因操作。一、基本概念（一）基本概念蛋白质工程：在基因工程技术的基础上通过对基因的定向突变改造，从而达到对原有蛋白质的结构与功能进行修饰，并可以离体表达的过程。一、基本概念（二）基因过程的基本原理 基因工程在大多数情况下其实指的是“狭义”的基因工程概念，即仅涉及基因工程中的核酸技术，而不涉及蛋白质结构改造、提取分离等蛋白质技术。按照狭义的基因工程概念，基因过程分为五个阶段：分、切、接、转、筛。 当然，在获得正确的重组体后，使重组体中外源基因在新的遗传背景下进行功能性表达，生成出人类所需要的活性物质，才是基因工程的最终目的。一、基本概念（二）基因过程的基本原理基因过程的基本过程（基本步骤）1. 分：分离目的基因和基因载体2. 切：限制性核酸内切酶对目的基因与基因载体进行切割3. 接：拼接目的基因与基因载体形成重组体 4. 转：将重组体转入受体菌 5. 筛：筛选出符合重组要求的重组体基因工程的基本过程转分筛切接主要内容一、基本概念二、基因工程相关的酶学三、基因工程的载体四、目的基因的制备五、载体DNA与目的基因的连接六、重组分子引入受体细胞七、重组体的鉴定和分析八、克隆基因的表达系统策略【自学】九、重组原核微生物生产药物二、基因工程相关的酶学重组DNA中常用的工具酶二、基因工程相关的酶学重组DNA中常用的工具酶GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶 基因工程上使用的限制性核酸内切酶是一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列并能产生具有二重对称特异序列结构（即回文结构）的核酸水解酶。Bam HⅠ+回文诗两首夏 景 诗 香莲碧水动风凉， 水动风凉夏日长。 长日夏凉风动水， 凉风动水碧莲香。冬 景 诗 红炉透炭炙寒风，炭炙寒风御隆冬。冬隆御风寒炙炭，风寒炙炭透炉红。 二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶1. 命名第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写第四个字母代表株用罗马数字表示在该菌中发现该酶的先后次序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Hin dⅢ 属 系 株 序限制性核酸内切酶的命名第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写第四个字母代表株用罗马数字表示在该菌中发现该酶的先后次序二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶2. 分类 依据其识别及切割位点的特异性分为三类：I型：识别非对称序列，在距识别位点不少于1000bp处随机切割核酸链II型：识别4-8bp具回文结构的核酸序列，并在识别点或附近切割核酸链III型：识别5-7bp非对称序列，在距识别位点3-端24-26bp处切割核酸链二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶3. II型限制性核酸内切酶的基本特性（1）能识别双链DNA中含有的4-8个核苷酸碱基对组成的特定部位并切割使DNA分子产生断裂（2）断裂的DNA可以形成粘性末端或平头末端 当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时：若在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，称为粘性末端。 若切口处为碱基配对的平整末端，称为平头末端。HindⅡBam HⅠGGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCTAG++GATCC GGTCCAGGACCTG粘性末端 与 平头末端GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGBam HⅠGATCC G+GCCTAGBstⅠ二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶3. II型限制性核酸内切酶的基本特性（3）同裂酶：指来源不同但能识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶，又称异源同工酶。二、基因工程相关的酶学（一）限制性核酸内切酶3. II型限制性核酸内切酶的基本特性（4）同尾酶：指来源及识别序