10蛋白质复性.ppt

蛋白质复性 主要内容： 包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 蛋白质复性 基因工程取得的成果 A、基因工程的一般过程 B、抗虫棉、天然彩色棉 C、高附加值的药品： 白细胞介素-II、?-(or ?- or ?-)干扰素、humulin、牛生长素、anti-thrombin-III 、IgG、GM-CSF、TPA等 D、基因牛 存在的问题 A、包含体 B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌） C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母） D、大肠杆菌的内毒素 包含体的解决方法（一般步骤） A、包含体的分离 B、包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS C、变形蛋白质的复性和重新氧化 D、一般的分离纯化 例：人?-干扰素的后处理工艺 发酵液 离心(发酵液冷却至10?C以下，4000r/min离心10min) 菌体 细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包含体 提取变性(包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min) 变性液 稀释(取1份变形液+99份上述buffer(不含DTT)，使尿素浓度小于0.1M，4?C下搅拌24h） 复性液 浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min) 浓缩上清液 Sephacryl s-200柱层析分离 层析柱2?100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱，收集主峰、冻干、终产物(纯度可达100%，DNA及热源合格) 矛盾： 重组蛋白质的高表达 包含体的形成 天堂？ 地狱？ 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包含体的形成，虽然包含体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包含体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。 一、包含体： 1.1包含体的定义、组成与特性： 包含体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。?? 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 NMR等新技术的应用表明包含体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 1.2包含体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 ??????? 简化的蛋白质折叠动力学模型 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高 ? 超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包含体，表达量越高越容易形成包含体。 原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成： 一般说含硫氨基酸越多越易形成包含体，而脯氨酸的含量明显与包含体的形成呈正相关。 1.2.3、重组蛋白所处的环境： 发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包含体。 1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白 由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包含体沉淀。 1.2.5、蛋白质在合成之后， 中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包含体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，能达到菌体蛋白的30%,也不形成包含体，而以可溶形式出现。 1.2.6、在细菌分泌的某个阶段， 蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包含体的形成。 1.3包含体破菌、分离、洗涤及溶解 ?? 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬