酶工程实验 小麦萌发前后淀粉酶活力的.ppt

实验六?? 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、实验目的 1. 学习提取淀粉酶的方法。 2. 学习测定淀粉酶活力的方法。 3. 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、实验原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成麦芽糖、葡萄糖等小分子物质而被机体利用。 淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。 淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、试剂 1.? 0.1％标准麦芽糖溶液 ：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 2．pH 6.9，0.02mol／L磷酸缓冲液 100毫升 3．1％淀粉溶液：1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02mol／L磷酸缓冲液，其中含有 0.006mol／L氯化钠。 4．1％3,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔／L的氢氧化钠溶液和50毫升水中；再加人30克酒石酸钾钠，定容至100毫升。若溶液混浊，可过滤。 5．1％氯化钠 6．石英砂 四、操作步骤 1．种子发芽： 小麦种子浸泡2.5 h后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2． 酶液提取： 取发芽第3-4天的幼苗15株，放人乳钵内，加适量石英砂(200mg)，加 1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心（3000转／min）10分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积V。进行酶活力测定时，将酶提取液用Ph6.9的磷酸缓冲液稀释10倍。 取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。 3．酶活力测定： ?（1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。 1（干种子） 2（湿种子） 3（标准管） 4（空白管） 酶液 0.5 0.5 ---- ---- 标准麦芽糖溶液 ---- ---- 0.5 ---- 淀粉溶液 1 1 1 1 蒸馏水 ---- ---- ---- 0.5 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人1％ 3，5-二硝基水杨酸溶液2毫升。 （2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。 （3）用空白管作对照；在500nm处测定各管的光吸收值，记录结果。 4．计 算 本实验规定：25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知 C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准 则15粒种子或幼苗的总活力单位= C酶×N酶×V酶 N为酶液的稀释倍数 V为提取酶液的总体积 思考题 1 提纯酶的过程需要注意什么问题？ 2 为什么此酶的提取过程需要在0-4℃条件下进行？而测酶活力时要在25℃预保温？反应后又放入到沸水浴？