酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立_培训课件.ppt

四、获得高效价的伤寒O抗体的原因分析 ①在抗体的制备过程中，免疫动物的选择，设计有效的免疫程序均可影响制备的抗体质量。实验中采用伤寒沙门菌O抗原，通过耳缘静脉注射和多点背部皮内注射免疫健康家兔，制备伤寒沙门氏菌O抗体。 ②与家兔个体有关，免疫的家兔免疫功能强大，产生抗体量较多。 ③家兔是否每次均被抗原免疫到也是实验成功的关键，获得高效价抗体，也与足量的伤寒沙门氏菌菌体抗原和成功注入有关。 ④抗原直接进入血液被免疫细胞包裹而缓慢地释放，有利于持续地刺激免疫系统。但免疫时要注意抗原浓度和剂量的掌握，避免因抗原浓度太高和抗原剂量太大造成家兔死亡，而太低则不足以刺激机体产生特异的免疫应答。 ⑤所用的伤寒O抗原纯化度好。 五、ELISA实验的应用 在医学研究和临床诊断上，广泛地应用ELISA技术来检测与感染性疾病有关的病原因子及其相应的抗体、体液中的其他抗原成分、激素和药物等。 ELISA酶免疫测定商品试剂检测的项目可分为以下各类。 ①病原体及其抗体的检测。病毒感染如肝炎病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、疮疹病毒、 轮状病毒、义滋病病毒(HIV)、非典病毒(SARS)等；细菌感染如链球菌、布氏杆菌等； 寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 ②蛋白质。各种免疫球蛋白；肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶； 激素如HCG、FSH、TSH、hGH；酶如肌酸激酶-MB；其他蛋自质如铁蛋自等。 ③非肽类激素。如T1、T4、雌二醇、皮质醇等。 ④药物。治疗心肌病药物如地谷新、抗哮喘药物如茶碱、抗癫痫药物如苯巴比妥、抗生素如庆大霉素等。 ELISA除了在医学检测中的应用外，还在食品检测，水产品检测，植物病毒检测，动物检疫检测，农药残留检测，兽药残留检测，捕食作用研究等多个方面有广泛的应用价值。 谢谢！ “ ” “ ” 酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立 李金泽，郑欣宁，杨芳芳，郑思涵 2015年11月9日 一、何为伤寒 伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但在目前的传染病防治中，仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”，指许多热性疾病，在中医学属于“湿温”病范畴，与现代医学的伤寒与副伤寒，具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病，并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症，单核吞噬细胞系统的增生性反应，以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。 二、伤寒的检测 伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多 。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。 一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检测法,我们建立了ELISA试验,检测伤寒病人血清中O抗体, 我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，经分离与粗纯化，得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体，建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。 三、ELISA 实验原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接的放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 竞争法 竞争法(Compering ELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例， 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于因相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：①将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体，洗涤、封板；②待测管中加受枪标本与一定量酶标抗原的混合溶液，使之与因相抗体反应。如受检标本中无抗 原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。这样，受捡标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体的结合，竞争性的占去了晦标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。参考管中只加酶标抗原。孵育后，酶体抗原与固相抗体的结合可达最充分的量、洗涤。③加庇物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考音颜色深度与待测管颜色深度之差