酶在食品中的应用讲稿.ppt

来源于A. tumefaciens和C. cellulolyticum的DPEase酶及来源于 P. cichorii的DTEase酶的晶体结构被揭示。DTEase家族酶具有一个典型的TIM桶状结构,由8个重复的β-折叠和α-螺旋单元构成(β/α)8结构。其中包含的金属离子结合位点表明金属离子在催化时对于底物结合有重要的作用可稳定差向异构化过程中生成的烯二醇中间产物。 Clostridium bolteae D-阿洛酮糖3-差向异构酶的蛋白质工程与食品级表达 江南大学 食品生物技术 2014.6 糖尿病是一种世界性新兴的疾病, 严重威胁人类的健康。研究表明,单一糖类消耗成为糖尿病发病的主要因素之一。因此,利用低血糖应答的甜味剂代替蔗糖成为预防糖尿病的有效方法。 D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体,是一种己酮糖甜味剂,属于稀有糖。 D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%,但其能量仅为蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神经保护等重要的生理功能。在食品加工过程中,可改善凝胶特性并可产生良好的风味。 D-阿洛酮糖在天然产品中存在较少,但生物催化新技术的开发使D-阿洛酮糖的大规模生产成为可能。 本研究前期利用鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613 进行全细胞反应,确定该菌株具有催化 D-果糖差向异构生成 D-阿洛酮糖的能力,无副产物产生。 在此基础上,对该鲍氏梭菌(C. bolteae)ATCC BAA-613 全基因组中预测的 DPEase 酶基因进行克隆、表达;对 DPEase 酶进行分离纯化、酶学性质、构效关系及分子改造等方面进行研究;实现 DPEase 酶在食品级宿主枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 中表达,并分别基于 Cre/lox 系统和反向筛选标记 mazF 基因,成功构建食品级表达系统。 1、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 （1）、 C. bolteae DTEase 酶基因的扩增 （2）、 PCR 产物的克隆 （3）、 C. bolteae DTEase 酶基因的测序及序列分析 （4）、 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶表达质粒的构建 （5）、诱导表达条件的优化 （6）、重组 E. coli 细胞催化 D-果糖差向异构化反应 （7）、 D-阿洛酮糖的鉴定 证明基因CLOBOL_00069 所翻译的假定蛋白,其关键序列与 DTEase 家族酶有很高的同源性,具有相同的保守序列,因此,EDP19602 可能是一种 DTEase 家族酶。 将质粒 pMD-CLOBOL_00069 与载体 pET-22b(+)分别用 Nde I 和 Xho I 酶切后,回收酶切产物的目的条带纯化后进行连接,其构建过程如图 2-8 所示。载体 pET-22b(+)带有C 末端 His-Tag 序列,利用 pET-22b(+)表达的重组蛋白带有 6 个 His 标记,可利用Ni2+-Chelating Fase Flow 亲和色谱柱进行纯化。 2、C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的分离、 纯化及酶学性质研究 （1）、 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析 （2）、 Superdex 200 (10/300 GL) 凝胶层析纯化结果 （3）、 Superdex 200 凝胶色谱确定 C. bolteae DPEase 酶的分子量 （4）、 金属离子对 C. bolteae DPEase 酶酶活的影响 （5）、C. bolteae DPEase 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 （6）、C. bolteae DPEase 酶的最适温度及热稳定性 （7）、 C. bolteae DPEase 酶的底物特异性及酶反应动力学参数研究 （8）、C. bolteae DPEase 酶的平衡率 C. bolteae DTEase酶亚基分子量约为34 kDa,比预测的分子量33 kDa大约1 kDa,可能是由于在其C端增加6个组氨酸标签。 经过 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析柱纯化后,即可获得较纯的目的蛋白。 计算得到目的蛋白分子量约为139 kDa,说明该DTEase酶可能是四聚体。此结果与来源于A. Tumefaciens和C. cellulolyticum等DTEase家族酶中的DPEase酶一致。 该酶的最适反应 pH 为 7.0。中性环境下,酶活损失较低,在 pH 6.0~7.5的缓冲液中保持 2 h 后,残余酶活可在 90%以上;而在