食品化学_蛋白质的性质及分离分析技术.ppt

* * * * * * * * * 沉降的概念 沉降速率：v=dx/dt 沉降常数与单位 应用： 沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）； 五、蛋白质的沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应 六、蛋白质的颜色反应 1. 双缩脲反应 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫红，蓝紫 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度 六、蛋白质的颜色反应 2. 茚三酮反应 灵敏度差。 3.考马斯亮蓝G-250 本身为棕色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高 11000微克/毫升 六、蛋白质的颜色反应 4. 福林酚试剂反应 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍 六、蛋白质的颜色反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应 生成黄色化合物 指甲、皮肤、毛发 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 六、蛋白质的颜色反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸 六、蛋白质的颜色反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸 七、蛋白质的紫外吸收性质 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。可以对蛋白质进行定性和定量检测。 蛋白质浓度（mg/ml） =1.45A280—0.74A260 蛋白质的分离纯化 一、分离纯化的基本方法 1、盐析与等电点沉淀根据溶解度不同分离 2、层析法 离子交换层析法根据电荷不同分离 凝胶过滤法根据分子量、分子形状不同分离 亲和层析根据特异性亲和力不同分离 3、梯度离心法 2、层析 层析（chromatography）是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 What’s chromatography? 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。 离子交换层析分离蛋白质 凝胶过滤分离蛋白质 3、超速离心： 利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 二、蛋白质含量的测定 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、福林酚试剂法 4、紫外吸收法 三、蛋白质相对分子质量的测定 1、化学测定法 2、超离心沉降速度法 3、凝胶过滤法 4、SDS* * * * * * * * * * * * * * * 第六节 蛋白质的性质及分离分析技术 蛋白质的理化性质 一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质 一、蛋白质的两性解离与等电点 蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离性质，具有特定的等电点（pI）。 溶液pH＝pI时，蛋白质所带正负电荷相等； pH＞pI时，蛋白质带净负电荷； pH＜pI时，蛋白质带净正电荷。 等电点时特点： （1）净电荷为零 （2）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数 （3）多数蛋白质在水中等电点偏酸 碱性AA/酸性AA 等电点 胃蛋白酶 0.2 1.0 血红蛋白 1.7 6.7 细胞色素C 2