第10章 DNA克隆的基本过程.ppt

位点特异性重组 * * * * * * * * * * * * 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。 将质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。 1943年，Avery将有毒型肺炎双球菌DNA与无毒型肺炎双球菌一起培养，结果使无毒型肺炎双球菌转变为有毒型肺炎双球菌。其原因就是有毒型肺炎双球菌DNA进入无毒型肺炎双球菌中，引起其遗传性状改变。 外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。 整合后的外来DNA仍然可随染色体DNA一起复制，并在适当的条件下进行表达，但也可在相当长的一段时间内不表达。 * 整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。来源于宿主DNA的基因称为转导基因。 噬菌体感染宿主细胞后出现的溶菌生长途径和溶源菌途径就是典型的整合和转导的例子。 噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。 * * * * * * * * * * * * 转座又称为转位 * * 基因重组 在转化、转导或转座过程中，整段DNA在细胞内、细胞间或不同物种间进行转移，并发生DNA分子间的共价连接，简称重组（Recombination） 基因重组（Genetic Recombination）：整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的：分子克隆，DNA克隆 在整合酶的催化下，两段DNA序列的特异的位点处发生整合并共价连接，称为位点特异性重组 例如：?噬菌体的整合酶识别噬菌体DNA和宿主染色体的特异靶位点，而后发生的选择性整合 * * 同源重组 发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组（Homologous Recombination） 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 同源重组不依赖特异DNA序列，而依赖同源性 同源重组需要一些重组蛋白和酶。如大肠杆菌的Rec A、B、C、D及DNA连接酶等 * * 带有目的基因片段的重组载体在体外构建后，需导入适当的宿主细胞进行扩增，才能够获得大量纯一的重组DNA分子 选定的受体细胞必须具备使外源DNA进行复制的能力，且能表达由导入的重组载体所提供的某种表型特征，以利于导入细胞后的选择与鉴定 受体细胞的选择 * * 大肠杆菌受体细胞 限制缺陷型: 避免修饰和降解 导入过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制内切酶和甲基化酶的突变体，可以容忍外源DNA分子进入细胞体内并稳定地遗传给后代 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染 * * 概念: 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生暂时的变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的的细胞状态，称为感受态细胞（Competent cells） 对细菌细胞进行转化或转导的关键是细胞处在感受态，所谓感受态细胞，就是受体细胞处于摄入外源DNA的状态 感受态一般出现在对数生长期 感受态细胞的制备 * * 导入方法 转化：将质粒载体DNA分子或其它外源DNA导入感受态原核细胞(大肠杆菌)的过程 转导：把以噬菌体为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程 外源重组DNA导入原核受体细胞的途径 * * 仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液枪，微型离心管等 菌株：E.coli DH5α感受态细胞 质粒：pUC19+DNA成片段的重组质粒 pUC19质粒 LB培养基（Luria-Bertani）；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100μg／mL，X-gal 20-48μg/ml, IPTG 100 μg/ml） 一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000?储备液，用时按培养基的量再加入 预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） * * 转化 化学法(热击法)；用化学试剂（如CaCl2处理）制备的感受态细胞，通过热