20150517毕业论文王小玉.docx

分类号：学校代码：10541密 级：学 号南中医药大学硕士学位论文补肾活血方含药血清对体外培养卵巢颗粒细胞分泌功能及凋亡的影响研究生王小玉导师付灵梅 副教授刘慧萍 副教授专业学位中西医结合临床研究方向女性内分泌疾病的研究中国·湖南·长沙2015年5月原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本人了解湖南中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。必威体育官网网址□，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不必威体育官网网址□。 （请在以上方框内打“√”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年 月 日目 录摘 要ABSTRACT引 言11. 材料21.1. 实验动物21.2. 实验主要试剂21.2.1. 实验药品21.2.2. 实验试剂21.3. 实验仪器32. 方法32.1. 制备含药血清32.1.1. 实验动物分组32.1.2. 给药剂量的计算42.2. 制备卵巢颗粒细胞52.2.1. 卵巢颗粒细胞的分离与原代培养52.2.2. 卵巢颗粒细胞的传代培养52.3. 原代卵巢颗粒细胞的鉴定及形态学观察52.3.1. 多聚赖氨酸包被盖玻片52.3.2. 免疫组化学FSHR原代卵巢颗粒细胞鉴定62.3.3. HE染色细胞形态学观察62.4. WST法含药血清细胞毒性实验62.4.1. 操作步骤62.5. 各组血清干预体外培养卵巢颗粒细胞72.6. ELISA法E2的测定72.7. ELISA法P的测定82.8. 流式细胞术检测卵巢颗粒细胞凋亡率82.9. 统计学方法83. 结果与分析93.1. 原代卵巢颗粒细胞的体外培养93.1.1. 观察卵巢颗粒细胞的形态变化93.2. HE染色及FSHR鉴定103.3. 细胞毒性实验103.3.1. 空白血清细胞毒性实验103.3.2. 含药血清对颗粒细胞的毒性试验113.4. 含药血清干预后E2水平123.5. 含药血清干预后P水平测定123.6. 含药血清对细胞凋亡率的影响134. 讨论144.1. 补肾中药调节卵泡发育的研究164.2. 补肾活血方的组方依据174.3. 中医药调节卵泡发育的研究进展及发展趋势184.4. 补肾活血方含药血清对SD大鼠卵巢颗粒细胞的影响结果分析194.4.1. SD大鼠原代卵巢颗粒细胞的分离与培养194.4.2. 补肾活血方含药血清对卵巢颗粒胞分泌功能的影响204.4.3. 补肾活血方含药血清对卵巢颗粒细胞凋亡的影响205. 结论20致 谢22参考文献23附 录A：综述27补肾活血方含药血清对卵巢颗粒细胞的影响摘 要目的：探讨补肾活血方对卵巢颗粒细胞内分泌及凋亡的影响。方法：体外培养SD大鼠卵巢颗粒细胞，镜下观察卵巢颗粒细胞形态学变化，免疫组化FSHR进行颗粒细胞鉴定，HE染色进行细胞形态学观察，采用血清药理学的方法，观察补肾活血方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞内分泌功能及凋亡的影响。以FSH为西药对照，酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养基中E2、P水平，流式细胞术检测颗粒细胞的凋亡率。结果：卵巢颗粒细胞20分钟左右开始贴壁，3-4天进入对数生长期，14天左右大量凋亡，呈聚集样、胚胎干细胞集落状生长，免疫组化FSHR主要表达于细胞浆。加药刺激6小时后，E2检测：补肾活血高剂量组与空白组、中、低剂量组相比，有显著性差异（P0.01），与FSH组相比无明显差异（P0.05）；补肾中、低剂量组之间比较，具有统计学意义（P0.05）。P检测：补肾高剂量组与空白组、低剂量组相比有显著性差异（P0.01）；与FSH组、中剂量组相比，无明显差异（P0.5）。补肾活血高剂量组与空白组、中、低剂量组相比，凋亡率均有显著性差异(P0.01)，与FSH组相比具有统计学意义（P0.05）；补肾中、低剂量组相比，无统计学意义。结论：FSHR主要表达于细胞浆；补肾活血含药血清能够促进大鼠卵巢颗粒细胞分泌E2、P水平，并且能够降低颗粒细胞的凋亡率。关键词：补肾活血方；卵巢颗粒细胞；激素水平；细胞凋亡A Study in vitro on Granulosa Cell function and apoptosis of BuShenHuoXue DecoctionABSTRACTObje