基因工程考试大纲.doc

第一章 概论1 基因工程（genetic engineering）：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。 第二章 基因工程的酶学基础1 DNA操作酶根据其催化反应的类型分为5大类： (1)核酸酶：切开、切除或降解；核酸酶通过打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键来水解DNA分子。两种: 外切核酸酶(exonuleases)：从DNA分子的末端一个个地切除核苷酸。 内切核酸酶(endonuleases)：在一个DNA分子内部打开磷酸二酯键。 限制性内切酶：能够在有限的特定位点切开双链DNA。 (2)连接酶：将核酸分子连接起来；修复单链上的切口; 还能够连接两条双链DNA片段。 (3)聚合酶：复制核酸分子； 能够合成一条与已知模板DNA或RNA互补的新DNA链。DNA聚合酶I; DNA聚合酶I是典型的具备双重酶活性酶：既具备DNA合成酶活性也具备DNA水解酶活性。Klenow片段; Taq DNA聚合酶; 逆转录酶 所用到的模板是RNA而非DNA。 (4)修饰酶：去除或添加化学基团；通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，统称为DNA修饰酶。碱性磷酸酶;多核苷酸激酶;末端脱氧核苷酰转移酶 (5)拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或消除超螺旋。 2切割DNA的酶—限制性内切酶 基因克隆要求DNA分子以准确并可重复的方式被切割; 每一个载体都必须在一个单一位点被切割，以使新DNA插入;每个载体分子必须在环中的同一位置被切割，不能随机切割;限制性内切酶I和Ⅲ结构复杂，在基因工程中只承担很少的角色；限制性内切酶Ⅱ是基因克隆中用到、非常重要的酶。限制性内切酶Ⅱ（简称为限制性内切酶）核心特征：每种酶都有一段特定的识别序列，在这段序列上它们才能够切割DNA分子。许多限制性内切酶在识别序列处产生简单的双链断口。得到平末端或平端(blunt end或flush end)黏末端(sticky or cohesive ends)或黏性末端:DNA的两条链在不同的位置被切开，形成一种交错的切口，通常会隔开2或4个核苷酸，所得的DNA片断在末端都具有短的悬垂部分。黏末端之间的碱基配对能够将DNA分子重新连接起来。黏末端酶的一个重要特征是：不同识别位点的限制性内切酶 能够产生出相同的黏末端（Bam HI(识别序列GGATCC)、BglⅡ(识别AGATCT) 和Sau3A(识别序列GATC) 都能够产生GATC黏末端）。经这些酶切割产生的DNA片段，都能够通过每一个片段所携带的互补黏末端连接在一起。 第三章DNA的提取（ Extraction and Purification of DNA ） 1 DNA提取总原则 1）保证核酸一级结构的完整性； 2）其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4）其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 2组织DNA提取的方法步骤1）每克组织 + ml裂解液用组织匀浆器，匀浆 2）取2.0ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min，2,500rpm 10min3）取水相加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min, 2,500rpm 10min 4）取水相加5M NaCl至终浓度0.3M NaCl, 加2.5倍体积冰无水乙醇 ，摇匀，见白色沉淀,玻棒挑起DNA5）挑起DNA用70%乙醇洗涤一次沉淀溶于1ml TE适当稀释 6）紫外分光光度计测A260nm和A280nm 3质粒DNA的制备 与全细胞DNA的制备具有相同的一般方法：含质粒的细胞培养物，在液体培养基中生长； 细菌被收集，制成细胞提取物；细胞提取物被除掉蛋白质和RNA；利用乙醇沉淀法尽可能进行DNA浓缩。 第四章 RNA的提取 1所有RNA的提取过程中都有五个关键点：（注意的问题） 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 2 RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.细胞在用胰酶处理时过度。 D.溶液或离心管未经RNase去除处理。 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。 第五章 电泳 1凝胶电泳的种类 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶：相对大的孔道，分离大一些的分子；聚丙烯酰胺凝胶：很小的孔道，分离小的DNA分子，