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sephaex-LH20
sephadex-LH20
1 Sephadex LH20是一种价钱较高的填料,使用请千万注意,很贵的哟!(当然,老板有钱就另当别论拉)
2 先讲Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱, Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后,其实就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
5 分离的技巧,最后说说我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。
(2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。
(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质
(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用
问:在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?
解答如下:
1 在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.
当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是Sephadex LH20很明显),一般在丙酮,乙酸乙酯 中收缩很厉害,所以一般不用丙酮,乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积:
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
2 还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同,但有时(其实是多数情况下),都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是
1 样品一定要溶解(Sephadex LH20很贵,要保护填料,我看植化的同志对好填料看得都很重,职业问题,哈哈哈;同时,避免样品不溶解造成的脱尾)
2 溶解样品的体积尽可能小(色谱分离理论的基本要求,减小原始谱带宽度)
3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同(若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强,则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力;同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大,样品可能以为溶解性的问题而析出。)
以上三点是上样的基本要求,有时很难求全,只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1,2点,尽量满足第三点,“如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解”,请注意我的陈述“尽可能”,
3 还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?
如果实验室Sephadex LH20很珍贵,分道较纯再用, 如果实验室Sephadex LH20很普及,只要满足使用的注意事项,较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。日本的师兄都是用Sep
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