WesternBlottingProtocol中山大学(参考).doc

Western Bloting (张雪雁) 操作步骤： 做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。 蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加β—巯基乙醇，然后以PCR仪95℃变性10分钟。 上样、电泳： 上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。 将SDS—PAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。1х电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。 先以少量加有溴酚蓝1х上样缓冲液标记各泳道。 变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1х上样缓冲液补齐至50ul。蛋白Marker也补齐至50ul。 以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。 加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。 电转： 准备PVDF膜及滤纸。PVDF大小8.2х5～5.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。 将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡1～3分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。 小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。 接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。一般小分子量适合低电压，大分子量适合高电压。 5.封闭： 电转完毕后取出PVDF膜，置于5%的脱脂奶溶液中封闭。一小时或者4℃过夜。 一抗反应：将抗体以10ml 5%脱脂奶适合稀释，将PVDF膜浸入其中，置于脱色摇床上促进反应1小时。表达丰度低的蛋白可适当加长时间，比如4℃冷库过夜。 6.回收抗体。 7.TBST液摇洗膜，15分钟х3次 8.二抗反应：相应二抗以1：2000比例稀释至10ml。PVDF膜置于其中要洗40—50分钟。 9.TBST液洗膜，15分钟х3次 10.暗房发光洗片。 所需物品：滤纸，保鲜膜，压片盒，X光片，小镊子，1000ul移液器，枪头，配制发光液，solutionⅠ：solutionⅡ=1:1，一张膜需要2ml。 1）用纸吸干PVDF膜水分，在保鲜膜上浸泡于发光液1分钟，期间用镊子翻转几次促进均匀反应。 用纸吸干PVDF膜上剩余的发光液，裹于干净的保鲜膜里，只需一层。 2）PVDF膜平铺于压片盒，关灯，取X光片1~~2张铺与其上，扣紧压片盒。根据需要定制曝光时间。一般第一张1~5分钟。将剩余X光片密封避光保存妥善。 3）取出压片盒中X光片投入自动洗片机中冲洗。 Western Bloting相关试剂： Acrylamide / Bisacrylamide 30%(w/v) acrylamide(丙烯酰胺) (Bio-Rad 161--0101) 0.8%(w/v) methelenebisacrylamide (N-N’亚甲基双丙烯酰胺) （Gibco 155-16-024） 丙烯酰胺（Acr） 29g 亚甲基双丙烯酰胺(Bic ) 1g 超纯水至 100ml 37℃下溶解后，4℃brown bottle 保存，使用时恢复至室温且无沉淀。 4х Lower Tris 500ml Tris base(1.5M,m.w.121.1) 90.83g 10%SDS 20ml 超纯水至 500ml PH to 8.8(about HCL 12ml) 4х Upper Tris, 200ml Tris base（0.5M） 12.12g 10%SDS 8ml 超纯水至 200