Western_blot_实验技术20121115(阅读).ppt

初学者常见问题 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 ? 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 ? 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30min-1hr内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 背景太高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 THANKS! * * * * * * Western blot 实验技术 曹 红 2012.11.15 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。 Western blot 原理 Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。 由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。 Western Blot 信号放大基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot一般流程 底片扫描、分析 底物显色 二抗孵育 一抗孵育 封闭 转膜 SDS电泳 蛋白样品的制备 培养细胞：洗掉培养基，PBS洗2~3次，加入裂解液，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，超声波匀浆器匀浆，冰上静置30分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 组织样品：快速取材、液氮速冻、按每80毫克组织加1毫升的比例加入裂解液,超声波匀浆器匀浆，静置60分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清. 样品保存：避免反复冻融样品，EP管分装 -20度保存，不要超过2周，最长不要超过1个月；-80度（或-70度）保存，一般不超过半年，最多1年。 裂解液： Tris-HCl, EDTA, NP40 ， CHAPS, PMSF ， protein inhibitor ,（磷酸酶抑制剂：氟化钠、钒酸钠） 蛋白样品的制备 BCA（bicinchoninic acid, 二辛可酸）法测定蛋白浓度 原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物， 在562nm除有高地光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 浓度检测范围：10 - 2000ug/ml 步骤：(1)标准品与待测样品稀释(至检测范围）；(2)与等体积WR工作液混合；(3) 37度反应2hr；(4)测定562nm处光密度(OD)值; (4)绘制标准曲线并计算蛋白浓度 SDS（polyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝胶电泳) 原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应. SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当