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ELISA 原理及实验操作Elisa 简介酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)，简称ELISA，基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。原理：受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 加入酶反应 的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。优点：由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法 达 到高的敏感度。分类：直接 elisa、间接 elisa、夹心 elisa、竞争抑制 elisa直接 elisa亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型二抗，最后加底物显色即可。这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高，另外其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。可用于检测抗原和抗体。间接 elisa 间接ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的，再引入二抗（酶标）与一抗特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。 二抗一般为多抗，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时（可以由多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，提高灵敏度。 检测抗体的效价、血清的效价、单克隆抗体的筛选以及在临床诊断中检测标志性抗体。夹心 elisa直 接 夹心双抗夹心双抗原夹心 双抗夹心ELISA，待检抗原必须包括两个或者两个以上的表位，否则检测抗体无法与待检抗原结合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗夹心ELISA检测的。 双抗原夹心ELISA 中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，而间接ELISA 中使用的二抗一般只能识别IgG，因此双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。间 接 夹心 将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体：增加体系特异性）。 竞争抑制 elisa直 接 竞争抑制间 接 竞争抑制洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检原（或抗体）量成反比。用途：只有一个抗原表位的物质（多肽、小分子物质、小 分子激素等）、乙肝标志物（e抗原不稳定）等。步骤及注意事项包被蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。 包被DNA：板先经紫外线照射；先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被；用 亲和素先包被载体。脂类物质：在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹 干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 包被液：pH 9.6 碳酸盐缓冲液 pH 7.2 磷酸盐缓冲液 pH 7-8 Tris缓冲液包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定,没有绝对的选择,但有一个原则就是要尽可能的保持包被物的活性不被损失.目前常用的包被缓冲液有PBS,CBS,tris盐缓冲液,咪唑缓冲液等,一般来说,缓冲液的pH要大于蛋白质的pI,以保持其活性.???碱性包被液如碳酸盐用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主 要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易的与板子结合。包被量：0.1-1ug/孔 2. 洗涤 每次洗涤次数不少于3次，每次洗涤最好能浸泡30s，洗完晾干或拍干。 洗液： PBST、TBST、PBS 让大量不相关的蛋白填充无目的蛋白的空隙，从而排除elisa后续步骤中物质的吸附。封闭液：0.05%-0.5% BSA，10%小牛血清，1%明胶，5%脱脂奶粉4. 一抗孵育 一抗稀释时混合均匀，样品加孔底部，并注意不可溅出，不可产生气泡。5. 酶标二抗 常用酶：HRP，AP。6. 显色7. 终止3. 封闭问题重复性不好 1加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标板放置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作。尽可能模拟相同的反应条件。2加入标本后没有混匀。3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。4反应时间、温度等不相