PCR污染防治手册.doc

PCR污染防治手册 为什么要如此重视防治PCR污染？ 聚合酶链反应(polymerase?chain?reaction,?PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的。PCR产物一般为1013拷贝/ml而1mg人基因组DNA才含1.4106拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应的敏感性。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率也导致其易污染，极微量的污染便可导致假阳性结果。，主要存在个污染源：1.标本间的交叉污染； .PCR扩增产物的污染。其中以第个污染源，通过下面一个例子便可认识到PCR产物污染的严重性。在100ml的反应管中可产生1012拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池（50m25?m?*2m）内稀释后，0.1?ml稀释液含有400拷贝的扩增分子，远远超过了PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。PCR扩增产物的污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题追踪如果不慎发生污染， 用HPV的PCR扩增系统扩增如下模板： A:水---作为阴性对照，如果此管扩增出阳性，则可以判定为试剂已经污染或者是气溶胶污染。 B:阳性样品---作为阳性对照，验证实验是否成功。 C-X:---所要检查的地方，用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源0.1ml 去离子水浸泡如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，? PCR污染的预防 进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR 污染或杜绝污染的出现。1、划分操作区：实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行，包括扩增摸板的制备； PCR 加样区，包括反应液的配制和PCR 扩增； 分区的注意事项： 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 图二 2、实验操作的注意事项： A: 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； B: 使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少溅对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡A:定期监测：使用棉签涂抹的方法，一个月一次定期监测，监测地点为：超净台桌面、超净台内枪（包括枪吸孔内和枪体）、超净台枪头盒、超净台内常用PE管架及PCR管架，冰箱冰柜把手（两台）、冰箱内部（每个冰箱3个棉签包括冰箱内部表面和随机的冰箱内试剂盒）、常用试剂试剂盒、试剂表面。抽提桌面、抽提区枪（包括枪吸孔和枪体）、抽提区常用试管架、抽提区枪头盒、水浴锅水、沸水浴锅水，相关试验人员办公室桌面、鼠标、键盘。 需要做的工作：安排指定人员每月进行一次监测。每次监测填写记录表（见附表）。 B:物流： 严格单向物流，只允许从A区（样品制备及PCR加样区）到B区（PCR扩增及杂 交检测区）的物品流动。 B区任何物品(PCR管架、PE管架)进入A区前必须经过处理（1:100） 的84消毒液浸泡半小时）。各区物品单独使用，不允许交叉使用。 需要做的工作：A、物品A-B前处理(84浸泡后洗涤) C:人流：抽提、PCR以及B区必须要有单独的实验服，进入A、B两区进行实验必须穿上各自的实验服，不允许将实验服穿到另一个区。（注：如果进入一个区不是为了实验，可以不穿实验服，但绝对不允许穿另一个区的实验服进入）。实验服两周洗涤一次，但切记两个区的衣服不要在同一批洗，分成两次洗，可以这周洗涤这个区的下周洗涤另一个区的。 需要做的工作：指定一周轮一周洗涤衣服，各人衣服各人负责。 D:实验规程：1、实验时必须戴橡胶手套或薄膜手套；抽提桌面实验完成后用84擦洗；PCR实验室每天（实验量少的话可减少）晚上用紫外照射；如果在实验过程中发现有样品（包括抽提前和抽提后）或PCR产物必须立即用84擦洗；在B区如果手接触过桌