病理切片与免疫组化个人经验总结.doc

病理切片与免疫组化个人经验总结免疫组织化学中对载波片和盖波片的处理 （一） 载波片的清洁 进行免疫组化染色必须保证载波片的洁净否则常导致非特异性染色和组织脱片现象的出现而新的载波片常有油污等可能影响免疫组化染色的异物。因此必须对载波片进行清洁工作。常用的载波片清洁液是用重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水以不同比例混合配成不同强度的清洁液。 1． 常用清洁液的配制方法： 1．1重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=1：1：10 重铬酸钾10g., 浓硫酸10ml, 蒸馏水100ml 1.2重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：3：25 1.3重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：5：25 2载波片的清洁方法 1。1先将载波片用清洁液浸泡12-24h 1．2流水冲洗后再用蒸馏水清洗3-5遍 1。3 95%的酒精中浸泡2h，用纱布擦干 1．4放入60℃烤箱中烤干或者自然晾干储存在玻片盒内备用 （二）载玻片的表面处理 在免疫组化试验中由于实验操作步骤的繁多常引起组织切片或者细胞涂片的脱落，影响检测效果，因此常需要用粘附济对切片进行处理。 1APES黏附剂APES是一种新型玻片黏附剂它的黏附剂机制是通过对玻璃表面的化学修饰改变玻璃表面的化学物理特性使组织切片活细胞成分牢固的贴附于玻璃表面不易脱落并可长期保存。是目前应用最多的组织黏附剂。 1．1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml，混匀即可。 1．2切片处理方法1。1。1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min 1．1．2浸入APES工作液停留20-30s 1．1．3纯丙酮洗2次1。1。4放入烤箱37℃过夜1。1。5用干净玻片盒装好室温保存备用一般可存放半年以上 2多聚赖氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚赖氨酸水溶液是一种良好的组织黏附剂使用浓度在0。005-0。01％但是由于价格较高在免疫组化中很少用。 1．1多聚赖氨酸储备液的配制，将0.5g多聚赖氨酸充分溶于100 ml蒸馏水中，4℃或者-20℃保存备用（pll可反复水融）工作液可将pll原液稀释10-50倍使用 1。2切片的处理方法 1。1。1干净干燥切片浸入pll工作液，停留20-30s 1.1.3用干净玻片盒装好，室温保存备用一般可存放半年以上 （三）盖波片的处理 盖波片的处理方法如上,处理时间可适当缩短,清洁液浸泡2h即可（摘自常双锁主编医学常用实验技术精编）石蜡切片微波修复抗原染色程序 1载玻片防脱片剂处理：可选择APES或poly-l-lycine。捞片后置烤箱58-60℃30-60分钟以上使切片紧密黏附 2． 切片常规脱蜡至水 3．30％H2O2+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次 4．热修复抗原：将切片浸入0.01M购船酸盐缓冲液中（PH6。0），电路或微波炉加热之沸腾后断电间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS（PH7。2-7。6）洗1-2次。 5滴加5％BSA封闭液室温20分钟，甩去多余液体不洗。 6滴加适当稀释的抗（小鼠或兔IgG）.37℃1h左右或20℃时左右，也可4℃过夜，PBS（PH7。2-7。6）洗2分钟×3次。（一抗的稀释度孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说阳性染色强度不够时可提高一抗浓度和延长孵育时间背景过高时可降低一抗浓度和缩短孵育时间） 7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG（或兔、人IgG），20-37℃20分钟PBS（PH7。2-7。6）洗2分钟×3次。 8滴加试剂SABC,20-37℃20分钟. PBS（PH7。2-7。6）洗5分钟×4次. 9.DAB显色：使用DAB显色试剂盒（AR1022）。取蒸馏水1ml加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制反应时间,一般在5-30分钟之间.也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤 。 0．02M PBS（PH7。2-7。6）配法： 1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g,Na2HPO42.8g, Na2H2PO40.4g.如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。 0．02M枸椽酸盐缓冲液：1000ml蒸馏水中加枸椽酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸椽酸（C6H8O7·H2O）0.4g 注意事项： 如果染色背景较高，在SABC反应之后，DAB显色之前，用加水0。01-0。02％TWEEN20的PBS（PH7。2-7。6）洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后显色。 以上摘自武汉博士德生物工程有限工程公司所产的即用型SABC免疫组化染色试剂和使用说明书。 HE染色方法 1二甲苯I脱蜡10-15min 2二甲苯II脱蜡10-15min 3无水乙醇脱二甲苯1min×2次 4.95％乙醇 5. 90％乙醇 6.85％乙醇 7自来水洗2m