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临床检验中的发光免疫分析 发光（Luminescence）化学发光（Chemiluminescence）生物发光（Bioluminescence） 化学发光的分类 酶促化学发光： 辣根过氧化物酶系统 碱性磷酸酶系统 黄嘌呤氧化酶系统 非酶促化学发光： 吖啶酯系统 草酸酯系统 三价铁-鲁米诺系统 闪光与辉光及其测量方式的差别 免疫分析结果的干扰因素 化验结果与临床不符的原因 目前商品化发光免疫分析产品的几个特点 大多采用全自动工作方式，部分采用微孔板半自动方式 多采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积，使反应时间缩短 使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线 部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光) 流动池检测方式示意图 检测器 检测池 负压泵 废液 四通阀 冲洗液 样品管 计量泵 干燥空气 原位进样泵 氧化剂 优点：结构简单，运行成本低 缺点：易产生交叉污染，工作效率受限 标准化——自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求 对仪器的要求：结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少 对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简单化，具体为： 反应/洗涤/测定条件一致；操作步骤少且趋于一致 反应时间短； 通用成分多、专用成分少 措施 统一标记/检测系统 重新优化并统一反应/洗涤/测定条件和操作步骤 改变包被模式： 微粒包被：反应效率↑，反应时间↓；散射干扰↑ 、离子干扰↑ （磁珠） 间接包被：反应效率↓，反应时间↑；散射干扰↓ 、检测效率↑ 注意内源性物质干扰！（生物素-亲合素系统） 微粒+间接包被： 间接包被夹心法原理 包被体 待测抗原 间接包被物 标记抗体 俘获抗体 特点：所有试剂盒均采用同一包被物和结合配体 结合配体 工作曲线的特点与校正原理 工作曲线四要素 拟合方式：描述曲线基本形状，取决于实验模式和剂量-效应关系走向。 截距：描述曲线位置，修正依据为本底信号和系统误差，修正后导致曲线平移。 斜率：描述曲线俯仰角度，修正依据为结合/反应/检测效率。修正后导致曲线旋转。 变形因子：调整曲线形状（取决于抗体活性和特异干扰因素变化） 信 号 强 度 （Y） 待测物浓度（X） 基本形状 平移 旋转 变形 常见拟合方式的性质及其参数的含义 B/A C/A D A 曲线 Y=A*[X3+(B/A)*X2+(C/A)*X]+D Y=A*X3+B*X2+C*X+D 三次曲线 A B C D-C 曲线 Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C 四参数 A B N Y0-N 曲线 Y =(Y0-N) * eB*XA/(1+ eB*XA) + N ln[P/(1-P)]= A*lnX+B P=(Y-N)/(Y0-N) log-Logit A N (Y0-N) * 10B A=1直线 A≠1曲线 Y= (Y0-N) * 10B*XA+ N Log[（Y-N）/(Y0-N)] =A*logX+B 对数 / 变 形 B 截 距 A 斜率 直线 性质 Y=A*X+B 剂量-反应关系 Y=A*X+B 拟合方程 线性 拟合方式 X：待测物浓度； Y：信号强度； Y0：零浓度样品信号强度; N：非特异结合信号强度（NSB） 漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证！！！ 定值/非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段！（谨防作弊软件） 使用商品化发光免疫分析产品 可能遇到的几个问题 与以往方法（放免等）在检测指标的正常值及临床意义上的差异。 如：免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG、性激素等 采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异。 （单抗特异性好，受干扰小，因此测值低） 不同厂家产品测定结果之间一致性差（未与国家标准品比对）。 所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善。 部分产品不显示原始数据，无法监控其准确性。 温度 氧化剂 还原剂 光线 磁场 金属离子 防腐剂 杂质 本底物质 结合蛋白 （测定小分子） 同一干扰因素对不同检测方法的不同影响