流式细胞仪..ppt

利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性T 细胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，从而对LFA-1-adhesive T 细胞快速准确地测定。 白血病免疫分型 白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗。 应用流式细胞仪四色荧光标记技术， CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型。 血小板膜表面受体检测 血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。 细胞因子的检测 细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。 应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法。 二、流式细胞仪在血液学中的应用 血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。 FCM在血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广泛。 用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究 细胞经DNA荧光染料标记后，FCM可测定单个细胞DNA的含量，并描绘出DNA图形，经软件处理可计算出G0/G1、S、G2/M各细胞周期细胞所占的百分比。依据增殖指数可了解群体细胞的增殖活力。 通过染色，不仅可了解血/肿瘤细胞的增殖状况，更可用于化疗药物作用机制的探讨，从而将其区分为增殖周期特异性、非特异性药物，以及周期时相特异性、非特异性药物，以便更合理的配伍联合化疗方案，预测肿瘤细胞对药物的敏感性等。 三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细胞周期各时相的百分比和细胞周期动力学参数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染色技术。 四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 近年来荧光细胞化学技术的发展，以及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究中开辟了更广阔的应用前景。 五、FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析 利用FCM可以进行HLA-B27／HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又可排出交叉反应。通常58％～97％的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅2％～7％可检出这种抗原。FCM检测HLA-B27快速、特异、敏感，为强制性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。 六、流式细胞仪在药物学方面的应用 流式细胞仪在检测药物在细胞中的分布，研究药物的作用机制方面应用广泛。 亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等进行观察。 * * 1.散射光信号 射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。 （1）前向角散射 前向角散射与被测细胞的大小有关 （2）侧向角散射 侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 2.荧光信号 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。 2.荧光信号 （1）荧光信号线性测量和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。 （2）荧光信号的面积和宽度 荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA