第二讲体外受精..ppt

*  第十章：动物配子与 胚胎生物工程  第一讲：体外受精技术 一．概述 二．卵母细胞的体外成熟 三．卵子和精子的体外受精 四．早期胚胎的体外培养 五．影响体外受精的因素 六．应用前景  一、概述 （一）定义 从狭义上讲，体外受精（in vitro fertilization）是指将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括自然条件下的体外受精（两栖类和鱼类的正常生殖过程）和人为培养条件下的体外受精（哺乳动物）。哺乳动物的体外受精实质将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程。 体外受精的主要内容包括： 1）卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation,IVM) 2）卵子精子体外受精(in vitro fertilization,IVF)； 3）受精卵的体外培养(in vitro culture,IVC)。 体外受精程序 (二) 体外受精的意义 一、提高动物繁殖力的有效措施(精卵) 二、体外受精可为胚胎移植提供充足而廉价的胚胎,为工厂化生产胚胎提供可能 三、为其他动物繁殖生物技术，如动物克隆、动物转基因工程和胚胎干细胞等研究提供丰富的试验材料和必要的研究手段 四、有利于揭示受精的本质和机理，并有助于研究胚胎的分化和发育。 （三）研究历史 体外受精是在20世纪80年代初研究成功,并在近10年得到逐步完善的一项配子与胚胎生物技术,1959年，张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批体外受精的试管小兔;1982年，美国学者Brackett等成功报道世界首例体内成熟的卵母细胞经体外受精获得试管牛；体外成熟卵母细胞和完全体外化的试管牛也分别于1986年和1988年报道成功。目前,一套高效的牛胚胎体外生产程序已经建立起来,并逐步进入生产推广的产业化阶段。我国体外受精技术的研究起步于80年代后期，但进展很快，已先后在人和牛等8种动物取得成功。特别是人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年约有近千例试管婴儿诞生。 二、卵母细胞的体外成熟 （一）卵母细胞的采集 1. 离体卵巢采卵 母畜屠宰后，取出卵巢并方如盛有消毒的PBS或生理盐水的保温瓶（25~30℃）中，在4~6小时之内送到实验室。从卵巢上回收卵母细胞主要有两种方法： （1）卵泡抽吸法 用5~10ml的注射器连接一支16号针头，将针头插入卵泡而抽吸卵母细胞。此法的优点是容易操作且速度较快，但回收率偏低（60~80%）且易损伤卵母细胞周围的卵球细胞从而影响卵母细胞的质量 （2）卵巢解剖法 首先用手术剪刀将卵巢上的卵泡单个的剪下，然后在盛有回收液的器皿中用经消毒的刀片划破卵泡，最后将器皿置于解剖显微镜下收集卵母细胞。此法的优点是回收率高，可达90%以上。但操作复杂回收速度较慢而且容易造成污染。 2．活体采卵 卵母细胞的活体采集是通过体外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。因从屠宰场收集到的卵巢种质一般都相对较差，而通过对良种动物反复进行活体采卵可获得大量种质优良的卵母细胞，其胚胎生产的效率要比超数排卵高出数倍，且对动物的生产性能和生殖机能无太大影响。 （1）腹腔镜法 在腹壁切开一小口,插入腹腔镜、操作杆和穿刺针,通过操作杆和穿刺针的配合将卵母细胞抽吸出来。该法的优点是比较直观,容易掌握；缺点是工作量大,对母牛有损伤,不能频繁手术。 （2）B超引导法 将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处，术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵泡抽出。该法的优点是不用手术，操作的速度较快，对母牛的损伤较少，可频繁对母牛进行采卵，亦可对妊娠母牛进行采卵；缺点是操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。 据研究报道，母牛可每周采卵2次，每次可获得5~6枚卵母细胞，且持续2~3个月对母牛无不良影响。 （二）卵母细胞的体外成熟 1．培养液 用于卵母细胞体外成熟的基础培养液有TCM199，Ham’s F-10，Menezo’s B2，NUSC23和MEM等，其中应用最广泛的是TCM199。这些基础培养液上需添加一定浓度的血清（5~10%的FCS或ECS）和促性腺激素等成分。激素对卵母细胞体外成熟的作用不确定：在有血清存在的条件下，激素对卵母细胞体外成熟的作用不大，浓度过高