第五章固相析出分离法..ppt

第五章 固相析出分离法 ? 通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 ? 盐析法 ? 有机溶剂沉淀法 ? 等电点沉淀法 ? 结晶法 第一节 盐析法(salt precipitation) 定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 优点：简单、经济、较少变性 缺点：分辨率不高，要除盐 两种现象： 盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大 盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小 一、基本原理 原 理 ? 形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 ? 中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。 在盐析区，符合公式 logS=β-Ksμ S——蛋白质溶解度，g/L； μ—盐离子强度, Ci——i离子浓度，mol/L； Zi——i离子化合价； β——常数,为纵坐标上的截距; Ks——盐析常数。 β、KS ? β为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。 ? KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。 ? 两种类型： （1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作KS盐析法。 （2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。 二、影响盐析的因素 （一）、无机盐的种类 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。 PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I― NH4+＞K+＞Na+＞Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵 (二）溶质（蛋白质等）种类的影响 盐析分布曲线 （三）蛋白质浓度的影响 ? 蛋白质浓度提高，盐用量减少 （四）温度的影响 ? 温度的变化会影响β值。 ? 在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。 （五）pH的影响 ? 当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，β值最小。 ? 利用β值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质. 三、盐析操作 （一）盐析用盐的浓度表示 固体粉末 硫酸铵饱和溶液 常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最 终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为 4.1 mol／L，定义它为100%饱和度. （二）盐析方法和注意事项 1、分部盐析法 2、重复盐析法 3、反抽提法 一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量 的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度 盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。 分部盐析法 反抽提法(RNA聚合酶) 注意事项 ? “局部过浓” ? 温度（室温） ? 分离方法 第二节 有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation) ? 定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 一、基本原理 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 一些溶剂的介电常数 ? 优点： 乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。 ? 缺点： 容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆 二、影响沉淀效果的因素 （一）有机溶剂种类及用量 常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二）pH的影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。 （三）温度（低温沉淀） 有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。 （四）无机盐的含量 低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。 高盐：增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。 （五）某些金属离子的助沉淀作用 多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。 胰岛素精制： （六）样品浓度 浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。 浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。 蛋白质浓度0.5%～2%； 粘多糖浓度1%～2%。 第三节 其它沉淀方法 一、等电点沉淀法 对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。 杂蛋白 胰岛素纯化： 胰岛素 ? pH8 ? 除去碱性杂蛋白 ? pH3 ? 除去酸性杂蛋白 二、成盐沉淀法 金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法； 有机酸类复合盐沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹