第四章基因工程载体..ppt

利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件? 1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 4、TA克隆载体 原理：Taq酶特点 研制出了一种线形质粒，其3 ’端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体。 环化的质粒克隆载体  TA克隆载体姜颖等人于2000年提出了一般质粒克隆载体改造成TA克隆载体的方法。 Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR(酪氨酸)，抑制赭色表型 (成为白色)。不含外源DNA片段的YAC载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。插入的外源DNA片段的YAC重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 ?噬菌体和其DNA DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏蛋白基因之间的区段）。 2. ?噬菌体的基因组特点 ? genome(48502bp) ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3. ?DNA的复制模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 滚环复制 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理： 4. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ①在这个非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点 ?噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！ 删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型： ① 插入型载体（insertion vectors)： 如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： 在?基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ’ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片段置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 13 1）? EMBL4 ? EMBL4的可置换片段内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片段，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 2）Charon40 Charon40的可置换片段是由DNA短片重复构成，片段之间有Hae I 切点。 在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片段切成小片段，以防止重新与载体连接。 左臂 可置换区 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片段中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。 （4）?载体的筛选标记 ② 插入型载体 根据插入所引起的表型突变。 ① 置换型载体 ?载体克隆策略 置换型载体 ? DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 5. ?载体的体外包装 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 必须利用噬菌体外壳的作用！ （1）体外包装： 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。 （2）体外包装过程 ① ?噬菌体外壳蛋白的合成 E 基因 的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。 D基因 E基因突变 只合成尾部蛋白和包