鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定_培训课件.ppt

实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。 饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量： V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。 固体硫酸铵法 所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。 现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。 SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate） 破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18?，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。使蛋白质的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。 当蛋白质的分子量在11，700~165，000之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系，符合直线方程式： LgMw= —bx + k 式中：Mw为蛋白质分子量，X为电泳迁移率，k和b均为常数。利用这一关系将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其孔隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的孔隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶。 连续体系；不连续体系 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein (1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 5～15% SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 *丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）? 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 实验步骤 1.蛋清准备 取1枚鲜鸡蛋，洗净擦干，在小头用镊子轻轻捣一直径为4mm的小孔，下用烧杯或量筒接好，再在大头打一细小针孔进气，此时蛋清缓缓自动流出。取蛋清的操作应很细致，避免蛋黄破裂混入蛋清而影响实验结果。将所得鸡蛋清充分打匀（约15分钟）。打时力戒过猛以防止产生泡沫变性作用。然后用4层纱布滤去杂质，测量体积（或体重），记录pH值。 2 热变性 取稀盐酸调节鸡蛋清pH值 5.5左右（4-7）、70℃处理15分钟。离心，去沉淀，保留上清。 3 分步盐析 取适量上清，先用1N的氢氧化钠后用0.1N NaOH溶液调至pH 8.0~8.5，加适量饱和硫酸铵溶液（pH 8.0）至饱和度为10%。冰浴放置30min。离心，弃上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul饱和硫酸铵）。 4 样品处理 取适量沉淀到