第一届实验培训2DE安排.doc

第一届全国先进电泳及其质谱联用新技术培训研讨会实验流程2DE 培训内容：双向凝胶电泳技术培训，包括1、新型等电聚焦电泳仪器，2、高分辨IEF新技术，3、高分辨2DE新技术 培训时间：8:30-11:50AM（3h20min），1:30-5:20 PM（3h50min） 地点：生物医药楼4－326 每次培训预定人数：18人 培训准备时间安排： 注：同一组颜色为一组培训内容，灰色为准备工作。测试样品为IEF marker。IEF仪器为伯楷安IEF仪。IPG为伯楷安IPG，pH3-10,7cm。PAGE预制胶为伯楷安PAGE预制胶，well 孔，12%。 21号8：30，水化胶条12根。 21号20：30，水化胶条12根。 21号22：30，聚焦电泳12根。 22号8：30聚焦结束。 8:30胶条平衡。 9:20转移第二向。 9:50聚焦电泳12根。 10:20技术讲解及仪器使用。 10:50凝胶固定染色。 11:20胶条水化12根。 13:30技术讲解。 14:00胶条平衡。 14:50转移第二向。 15:20胶条水化12根。 15:50讲解仪器使用。 16:30凝胶固定染色。 22:30聚焦12根。 23号8:30聚焦结束。 8:30胶条平衡。 9:20转移第二向。 9:50聚焦电泳12根。 10:20技术讲解。 10:50凝胶固定染色。 11:20胶条水化6根。 13:30技术讲解。 14:00胶条平衡。 14:50转移第二向。 15:20胶条水化6根。 15:50参观染色结果 16:20凝胶固定染色。 16:50讲解仪器使用 附件1：实验报告 附件2：2DE溶液配制 附件3：实验室发表文章 另附：伯楷安PAGE预制胶使用说明 上海交通大学生化分析与分离实验室 附件1：实验三 双向凝胶电泳分离IEF标准蛋白 目的要求 （1）通过IEF标准蛋白的分离，理解2DE分离原理。 （2）了解并掌握2DE技术的全程操作方法。 实验原理 双向电泳（2DE）是分析从细胞、组织或者其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分离。第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS）中利用蛋白质的分子量（Mr，相对分子量）大小将它们分离。 等电聚焦（IEF）：各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。（图2.1）。 图2.1 2DE原理示意图 SDS：SDS是阴离子变性剂，能将折叠的蛋白质分子打开并以一定的质量比（1.4:1）与蛋白质结合，这样所有的蛋白质都有相似的形状和荷质比，排除了蛋白质形状和所带电荷对电泳结果造成的影响，蛋白质分子迁移距离只跟蛋白质的分子量有关。在电场的影响下，带有SDS的负电荷的蛋白质向正极运动，分子量越大移动的越慢，反之，移动的越快。 试剂和器材 一、试剂 IEF standard protein(BioRad 公司)，预制胶条pH 3-10（上海伯楷安生物科技有限公司），SDS预制胶（上海伯楷安生物科技有限公司），二硫苏糖醇（BioRad 公司），碘乙酰胺（BioRad 公司），尿素、tris碱（sigma）。 实验过程中所用溶液配制参考附件文件。 二、器材 等电聚焦仪（上海伯楷安生物技术有限公司），水化槽（BioRad 公司），mini垂直板电泳装置（BioRad 公司）。 图2.2 等电聚焦仪 图 2.3 SDS装置 操作方法 等电聚焦操作： 取出IPG预制胶条（7cm pH 3-10），室温平衡。 在聚焦盘或水化盘中加入样品。 去除预制IPG胶条上的保护层。 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中。 在每根胶条上覆盖1ml矿物油，水化6-10小时。 将胶条从水化盘中取出，去除矿物油后，将其放入等电聚焦盘内，对好正、负极，盖上盖子。 设置等电聚焦程序并运行。 胶条平衡： 配制胶条平衡缓冲液 I 。 取出聚焦好的胶条，吸去胶条上的矿物油。 将胶条放入平衡盘进行第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 进行第二次平衡 ，振荡15分钟。 SDS操作： 吸去预制胶玻璃板中液体。将玻璃板平放在桌面上。 琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 将放有胶条