分子生物学分子克隆.ppt

碱性磷酸酶处理载体分子后连接 如果是构建表达型重组体，因为启动子启动转录以及转录后翻译阅读都是有方向的，因此插入的目的基因也应注意方向。一般采用两种限制酶消化，由于粘性末端不同，载体分子和外源DNA片段只能按一种方向形成重组分子，实现定向克隆 定向克隆 连接效果与载体和 目的片段质量有关 3：1 10μl 连接反应一般 约4-5小时，室温，20度左右 平端连接 因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成平端。有时所需用的两种限制性内切酶切割后形成非互补的粘性末端，此时需设法使之变成平端，如用S1核酸酶消化或用Klenow片段和dNTP补平3‘ 端，成为平末端。 平末端仍用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。 人工接头连接 连接子（linker）是指人工合成的一段双链寡核苷酸，其中包含一个（或两个）酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。 加插头连接 插头（adaptor，又叫适配子）与接头的区别在于其一侧末端是一个粘性末端（内含限制性内切酶位点），而另一侧为平末端，也可以是粘末端。将其与目的DNA片段进行平端或粘端连接后，即可直接与载体连接。 通过PCR获得粘末端 PCR技术的出现大大方便了基因的克隆。在进行PCR时，可根据载体上的克隆位点设计PCR引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列，通过PCR或RT─PCR直接产生可用于重组的外源基因片段。 T-A克隆 TaqDNA聚合酶扩增目的DNA同时，在其末端加两个游离的“A” 只要载体切口处人工加上游离的“T”，PCR产物即可与载体连接。 五、重组DNA导入受体细胞 目的基因与载体在体外重组后应导入受体细胞中才能扩增并进一步筛选。 　　转化（transformation）将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程。 　　感染（infection）以噬菌体粘性质粒和真核病毒作载体构建的重组分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或嗜菌体颗粒，感染适当细胞并在细胞内扩增的过程。 还有一个易混淆的名称是转导（transduction），它是指细菌基因被一个噬菌体从一个细菌转移到另一个细菌的过程。 　　转染（transfection ）是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 基因工程中的受体细胞又叫宿主细胞，分为两类：原核细胞（如大肠杆菌、枯草杆菌等）和真核细胞（如酵母细胞、哺乳动物细胞及昆虫细胞等）。 1、容易接纳重组分子。 2、对载体的复制扩增无严格限制。 3、不存在特异的内切酶降解外源DNA。 4、不对外源DNA进行修饰。 5、还需根据选用的载体及其所具备的筛选标记。 如质粒pBR322用氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）作筛选标记，受体细胞则用对Amp和Tet敏感的大肠杆菌HB101细胞。 将外源DNA导入靶细胞的方法很多，应根据实验目的、受体细胞种类、外源基因大小等不同来选择。 导入方法大致分为三类 ⑴化学方法：如CaCl2转化法、磷酸钙共沉淀法。在磷酸钙DNA共沉淀方法中将被转化的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，通过内吞作用进入受体细胞。另外还有DEAE─葡聚糖转化法等。 ⑵物理方法：如电脉冲介导法、显微注射法、基因发射枪一类的颗粒轰击技术等。在转基因动物实验中，对体积较大的受精卵细胞或胚胎干细胞，可将目的基因重组体通过微吸管直接注射入细胞核，即显微注射法，此法需要精密仪器及高超技术。 ⑶生物方法：包括原生质融合法、脂质体介导法，以及λ噬菌体的体外包装感染法和逆转录病毒和DNA病毒介导的转染法。其中重组逆转录病毒和重组DNA病毒（如腺病毒）转染受体细胞目前常应用于遗传疾病或肿瘤的基因治疗中。 基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competent cell）。 感受态细胞 Ca2+诱导的完整细胞的转化（大肠杆菌，革兰氏阳性）1970年建立了此技术，其原理是与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩作用，使细胞出现空隙，细菌这时的状态就是感受态。 六、阳性克隆的筛选