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乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建 H BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建 这个质粒在乳酸克鲁维酵母及大肠杆菌中都能复制 Xba I Sal I 插入片段的方向通过电泳检查Xba I和Sal I双酶切片段的大小来确定 2 重组表达质粒的转化及H BsAg的表达 人组织型纤溶酶原激活剂组合突变株CHO 细胞株的组建 真核表达质粒pLFrGGI的构建 FrGGI SV40E Ad M LP SV40P 采用二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂氨甲喋呤(M T X)选择加压共扩增 外源基因。 2 高效表达FrGGI（t P A突变体）的C H O 细胞株的获得 以两个引物所结合的单链cDNA (靶序列)为模板,在Taq 聚合酶的作用下进行PCR 扩增,合成双链目的cDNA (1)聚合酶链式反应（PCR ）体外扩增DNA 技术 Polymerase chain reaction 应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA 序列的拷贝 宏观与微观的联系 PCR 技术的基本原理：首先使双链DNA 在反应液中热变性而分开成单 链，然后在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA 配对结合 ，再在中温下利用Taq DNA 聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合（ 延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三个步骤为一个循环，通 过三个温度的不同循环。 PCR 反应体系的组成 a. 含靶序列的DNA 需用0.2-2g 基因组DNA b. 寡核苷酸（引物） 20-24个核苷酸 1 mol/ L 尽量选择碱基随机分布的序列 GC含量尽可能接近50 % 避免因较长的互补序列而形成引物二聚体或发夹结构 使其5’端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既含有目标序列，两侧 又带有限制酶切位点。 Taq DNA 聚合酶 工程酶（AmpliTaqTM ） 酶量为1-5u d. 四种d NTP 50-200 mol/ L PCR缓冲液 10 mmol/ L Tris HCl（pH 8.3 ，于室温） 1.5 mmol/ L MgCl2 Mg2+ 为1.5 mmol/ L PCR 体外扩增DNA 操作过程 PCR 自动扩增仪 （2）PCR 扩增由 mRNA 反转录而成的cDNA ‘上游’寡核苷酸引物 ‘下游’寡核苷酸引物 DNA 体外重组是将目的基因（外源DNA 片段）用DNA 连接酶在体 外连接到合适的载体DNA 上，这种重新组合的DNA 称为重组DNA ，简称 重组体。 目的基因DNA 与质粒载体DNA 的连接 定向克隆法 当用两种不同的限制酶（如用BamH I和Hind III）消化外源DNA 时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA 片段。 排阻凝胶层析 以便与切下来的小片段分开 避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点 粘性末端连接法 质粒载体和外源DNA 都可能发生自身环化或形成串联寡聚物 用碱性磷酸酶去除线状载体DNA 两端的5’磷酸基团以尽量减少载 目的基因与克隆载体的体外重组 体DNA 的自身环化或连接。 经去磷酸化的载体DNA 仍然可有效的与具有5’末端磷酸的外源DNA 相连接，产生含有两个切口的环状重组DNA 分子，可直接转化并由宿主菌 修复切口。 这种带切口的环状DNA 的转化效率比线状DNA 高得多 应含有足量的载体DNA 平端连接法 平整末端连接属于低效反应 极高浓度的T4 噬菌体DNA 连接酶 高浓度的平整末端外源DNA 和质粒DNA 低浓度（0.5 mmol/ L）的ATP 不存在亚精胺一类的多胺 适量的凝聚剂 快速克隆法 需从纯化的凝胶中回收含目的条带的琼脂糖块，熔化后直接进行 质粒载体和外源DNA 的连接。 同聚物加尾法 末端转移酶可催化dNTP 加到单链或双链DNA 3’羟基端的能力，在 目的DNA 和质粒载体上加入互补同聚物，两者在通过互补同聚物之间氢 键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。 采用GC加尾，即将dC残基加到双链cDNA 上，而将互补的dG残基加到 用Pst I消化的质粒载体上。 加合成接头或衔接头法 合成接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（8-12bp ）而 两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体。