使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS.doc

使用流式细胞仪检测活细胞内的ROS 基本原理：CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH , DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF?，用于检测ROS?的生成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非极性的化学物质能自由通透细胞膜。进入细胞后，被easterase去掉两个乙基,?形成具有极性的2’,7’- dichlorodihydrofluorescein(DCFH),?保留在细胞内。当细胞产生H2O2与DCFH反应,使DCFH形成了2’,7’ –dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度。（见下图）主要试剂：1.PC-12细胞株2.DCFH-DA粉剂（sigma）3.5 mg溶解于721 ul 100%乙醇中（这时的浓度为10.0 mM），之后用DMEM培养液稀释上述溶液10倍，配置成1.0 mM的储存液。-20°С避光保存。3.Aβ25-35（终浓度为30uM）4.AP（终浓度为10 uM）5其它如培养细胞常用试剂（DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等），MTT操作方法：（1） 收集细胞：取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至（1～10）×106/mL（2） 分别加入Aβ、Aβ+AP（六孔板），培养24小时（3） 装载探针：加入终浓度为10uM的DCFH-DA，37 °С 5 % CO2培养箱中静置0.5 h，每隔3-5min混匀一下，使探针和细胞充分作用。（4）?用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。（5）?收获各组细胞，上流失细胞仪检测ROS。激发光488nm，发射光?525nm（6）?实验分四组：PC-12(空白对照组)、PC-12+DCFH-DA(探针对照组)、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35（实验组）、PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35+AP（给药组）结果分析：注意事项：（1） 处理过程绝对避光（紫外灯能不能开？）（2） 染料与细胞混合时间要充分（3） 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高（4） 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差（5） 细胞应保持良好的活性状态。贴壁细胞培养时不应超过瓶底面积的75%，悬浮细胞培养时其数目不能超过5×105/mL；贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速，避免产生过多的细胞碎片（6） 使用流式细胞仪要确保侧面的细胞分散开（在与染料混合和处理时）（7）?流式细胞仪对细胞数目有一定的要求，一般为106，可以使用六孔板（8）?虽然一般要求将阴性对照组细胞调节电压至阴性置信区，但如果正常对照细胞DCFH染色较强、锋行太偏右，可适当降低电压，将锋行调节至中间，以便观察药物的抑制或促进作用（9）?测荧光最好不用塑料管