外源基因在真核细胞中的表达.pptVIP

2、基因枪法（particle bombardment） ：是利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。最早由Klein TM在1987年创立，并将烟草花叶病毒RNA和CAT基因(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)导入洋葱表皮细胞。系统将带有包裹有目的基因的金属颗粒（金粒或钨粒），以很高的速度轰击植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。基因枪由激发器、枪管、挡板和无菌小室等组成。将一定量的带有目的基因的质粒DNA，CaCl2、亚精胺与钨粒一起离心或振荡，可将目的基因吸附于钨粒，通过基因枪把钨粒以430米/秒的速度轰击目标，使目的基因穿过细胞壁和细胞膜进入受体细胞。 3、超声波法： 根据超声波的空化作用，把外源基因导入受体细胞。1990年许宁等把GUS基因通过该方法导入了小麦幼穗愈伤组织。 4、聚乙二醇法（PEG）： PEG（polyethylene）具有细胞粘合作用和扰乱细胞膜的磷脂双分子层的作用。1980年由Darey最早利用该方法将外源基因转入原生质体。 1985年以后利用该方法将报告基因转入种植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。 PEG法转化率低，一般在10-5-10-6。 5、脂质体转化法：利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现转化。 6、真空渗入法： 利用真空作用使外源基因进入植物体，细胞并实现DNA的整合。 7、显微注射法： 利用显微装置将质粒DNA注射入宿主细胞的方法。利用极细(1μm)的玻璃毛细管装入待转移的外源DNA，然后在显微镜下直接将毛细管插入原生质体等细胞，并注射DNA。 （二）间接基因转移： 某些病原生物（农杆菌、病毒等）能够通过感染宿主细胞，将病原生物DNA整合到宿主细胞基因组中，因此改造病原DNA，利用其侵染能力，能将外源基因导入植物或动物细胞，产生转基因植物。 以农杆菌或病毒为载体的基因转移过程称为间接基因转移。 1、农杆菌介导的基因转移： （1）Ti质粒： 革兰氏阴性农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）中存在的一种质粒DNA。具有一段T－DNA能够将外源基因转入植物染色体DNA中并实现整合。Ti质粒约200Kb，一半序列参与质粒复制、冠瘿碱代谢和接合作用；对致瘤不起作用，另一半序列包括T－DNA区和毒性区（Vir region）。T－DNA：章鱼碱型农杆菌Ti质粒T－DNA由两部分组成，一部分与致瘤有关，称为左转移DNA（TL－DNA），另一部分与致瘤无关，称为右转移DNA（TR－DNA）。TL－DNA含有编码合成激素类和冠瘿碱类的基因，由于激素基因在植物细胞内的表达，产生了过量的生长素和细胞分裂素，破坏了内源激素平衡，而导致植物细胞发生癌变。 Vir区：是T－DNA以外涉及诱发肿瘤的区域，在Ti质粒的物理图上位于T－DNA左侧，长30－40Kb，Vir区并不整合入植物基因，但却是T－DNA转移所必需。 T－DNA边界序列：T－DNA长约23Kb，但在其两端边界各有一个25bp的正向重复序列，高度保守，一般认为右端重复序列对T－DNA转移起重要作用。 农杆菌转化植物细胞的机理： （1）农杆菌对植物伤口的附着； 植物伤口释放出信号分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羟基乙酰丁香酮（OHAS）等。 （2）Vir区基因表达的诱导； VirA以及VirG基因在酚类物质的诱导下得到表达。 （3）T－DNA中间体和T－链蛋白复合体的形成； VirD1和VirD2蛋白表达与T－DNA边界重复序列结合解缠绕与切割，VirC1和VirC2参与下，形成T－DNA转移中间体。并以DNA－蛋白质复合体形式存在和转移。VirE1和VirE2参与该过程。 （4）T－链蛋白复合体转移至植物细胞； T－链蛋白复合体（T－链、VirD2、VirE2）在VirB基因表达产物作用下，穿越细胞膜，VirB操纵子具有11个基因，产物定位于细胞膜上并形成一种膜结合T－复合体运输器，其中VirD2和VirE2蛋白分别具有导航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白进入植物细胞。 （5）T－DNA拷贝与植物基因组的整合。 T－链蛋白复合体转移到细胞后，通过核膜上的小孔进入细胞核，与核DNA整合。整合机制尚不清楚。 Agrobacteria attach to plant cell surfaces at wound sites. The plant release