实验二普通光学显微镜的使用幻灯片.pptVIP

实验二 普通光学显微镜的使用 一、目的要求 1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2、学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、基本原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成（图2-1）。 1.镜座；2.载物台；3.镜臂；4.棱镜套；5.镜筒； 6.接目镜；7.转换器；8.接物镜；9.聚光器；10. 虹彩光圈；11.光圈固定器；12.聚光器升降螺旋； 13.反光镜；14.细调节器；15.粗调节器；16.标本夹 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要又有如下两方面的原因： 1、增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100× ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大（图2-2）。 从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像 显现不清。所以为了不使 通过的光线有所损失，在 使用油镜时需在油镜和玻 片之间加入与玻璃的折射 率（n =1.55）相仿的镜油 （通常使用香柏油，其折 射率n =1.52）。 2、增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力（resolution or resolving power）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 式中：λ=光波波长，NA=物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7 μm），而数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n·sinθ 。 式中θ为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120°，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2 μm左右。 三、实验器材 1、菌种 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和四联球菌染色玻片标本。 2、溶液或试剂 香柏油、1:3酒精乙醚混合液。 3、仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸。 四、实验步骤 1、观察前的准备 （1） 显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4㎝。镜检时姿势要端正。 取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。 （2） 光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 （3） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。 （4） 聚光器数值孔径值的调节 调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看视野，一边缩光圈，调节光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应该进行这种调节。 在聚光器的数值孔径确定后，若需要改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度和照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。 2、显微观察 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵从由低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定